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Les porines sont-elles sur la membrane interne ou externe des mitochondries ?

Les porines sont-elles sur la membrane interne ou externe des mitochondries ?


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J'ai examiné plusieurs ressources et elles disent des choses différentes.


Ce n'est pas mon domaine, mais la base de données de classification des transporteurs semble être une source fiable et indique que :

Les membres les mieux caractérisés de la famille MPP sont les porines du canal sélectif anionique voltage-dépendant (VDAC) dans le membrane externe mitochondriale.

En cherchant dans la banque de données sur les protéines, on peut trouver une structure cristalline pour le canal anionique dépendant de la tension humaine 1 et l'article associé indique également qu'il se trouve dans la membrane mitochondriale externe, vous pouvez donc imaginer qu'ils devraient le savoir.


Espace intermembranaire

Les espace intermembranaire est la région entre la membrane interne et la membrane externe d'une mitochondrie ou d'un chloroplaste. Sa fonction principale est la phosphorylation des nucléotides. Les protéines de canal appelées porines dans la membrane externe permettent le libre mouvement des ions et des petites molécules dans le espace intermembranaire.

Au fur et à mesure que les électrons descendent les protéines dans la chaîne de transport d'électrons, les électrons perdent de l'énergie pour amener les ions H+ de la matrice mitochondriale dans la espace intermembranaire.

Espace intermembranaire
Les espace intermembranaire (SMI court) des mitochondries est la région qui se situe entre la membrane externe et interne des mitochondries. C'est le lieu où a lieu la phosphorylation oxydative [14].
Matrice mitochondriale.

est l'espace entre la membrane externe et la membrane interne. Il est également connu sous le nom d'espace périmitochondrial.

- L'espace entre la membrane externe et interne dans une mitochondrie.
Lysosome - Un organite lié à la membrane trouvé dans les cellules eucaryotes. Contient des acides et des enzymes qui dégradent les molécules indésirables.
Matrice - L'espace à l'intérieur de la membrane interne des mitochondries.

des mitochondries
C. Membrane interne des mitochondries
D. Matrice des mitochondries .

Le chloroplaste de forme ellipsoïde est enfermé dans une double membrane et la zone entre les deux couches qui composent la membrane est appelée la

. La couche externe de la double membrane est beaucoup plus perméable que la couche interne, qui comporte un certain nombre de protéines de transport membranaires intégrées.

L'intérieur des deux membranes s'appelle la matrice, l'espace entre les deux membranes s'appelle le

et les plis créés par la membrane interne sont appelés crêtes. Les mitochondries contiennent également leur propre ADN qui code certaines des enzymes utilisées à l'intérieur des mitochondries.

de la matrice mitochondriale.
293
98 .

Le gradient de protons se développe entre le

La mitochondrie est constituée de membranes externe et interne, un

(espace entre les membranes), les crêtes (plis de la membrane interne) et la matrice (espace à l'intérieur de la membrane interne). La membrane externe contient plusieurs porines qui forment des canaux où certaines molécules peuvent diffuser librement.

L'énergie libérée lorsque les électrons passent d'un porteur à un autre déplace les ions hydrogène (protons) à travers la membrane, de la matrice mitochondriale à la

, créant un gradient de concentration de protons.

Après un empoisonnement au cyanure, la chaîne de transport d'électrons ne peut plus pomper des électrons dans le

augmenterait et la synthèse d'ATP s'arrêterait.
B
C.

mitochondrie mitochondrie membrane externe membrane interne crêtes

Les composants de la phosphorylation oxydative - la chaîne de transport d'électrons et l'ATP synthase - sont intégrés dans la membrane mitochondriale interne. Les protons (+) sont pompés de la matrice dans l'espace rempli de fluide entre les deux membranes, également appelé "

L'espace entre les membranes externe et interne est appelé le

. À l'intérieur de la membrane interne se trouvent des structures plates ressemblant à des crêpes appelées thylakoïdes. Les thylakoïdes forment des empilements appelés grana.


Fonctions des mitochondries

Les mitochondries sont responsables de nombreuses activités majeures à l'intérieur d'une cellule :

  • C'est le site principal de la synthèse d'ATP et c'est pourquoi on l'appelle une centrale électrique de la cellule (phosphorylation oxydative). Les cellules comme les cellules musculaires, le foie, indiquent le taux plus élevé d'utilisation de l'ATP dans ces zones. Dans les globules rouges matures, les mitochondries sont absentes afin de créer plus d'espace pour l'hémoglobine pour la liaison à l'oxygène.
  • La membrane interne des mitochondries contient des protéines (particules F0-F1) qui sont impliquées dans le transport des électrons et la synthèse de l'ATP.

  • Les mitochondries ont un rôle vital dans l'absorption et la libération de Ca2+ qui maintient la concentration de calcium dans le cytoplasme des cellules.
  • Les mitochondries jouent également un rôle très essentiel dans le processus d'apoptose dans les cellules de mammifères. Les protéines de la famille BCL2 régulent la libération du cytochrome c de la membrane interne et externe des mitochondries qui, une fois dans le cytoplasme, provoque l'activation d'autres signaux apoptotiques, provoquant finalement la mort cellulaire.
  • Dans les tissus adipeux, les mitochondries libèrent de la chaleur via une chaîne de transport d'électrons.

Biocentre de l'Université de Würzburg, Würzburg, Allemagne

Biocentre de l'Université de Würzburg, Würzburg, Allemagne

Résumé

La membrane externe mitochondriale contient un canal qui est responsable du passage des métabolites hydrophiles à travers la membrane. La protéine formant des canaux connue pour de nombreux organismes, appelée porine mitochondriale ou VDAC (canal sélectif anionique dépendant de la tension), a une longueur d'environ 280 acides aminés. Les génomes des organismes eucaryotes contiennent plusieurs isoformes de porines dont la fonction n'est pas bien définie. La structure primaire des porines mitochondriales ou eucaryotes n'est pas particulièrement hydrophobe et les prédictions de structure secondaire suggèrent qu'un cylindre -baril typique de la structure secondaire des porines bactériennes forme également le canal mitochondrial. Les kinases impliquées dans le métabolisme mitochondrial telles que l'hexokinase ou la glycérokinase se lient à la porine et jouent un rôle important dans la formation de compartiments dans les mitochondries. Les porines mitochondriales sont voltage-dépendantes et passent en sous-états perméables aux ions à des tensions supérieures à 20 à 30 mV. Le canal ouvert a une petite préférence pour les anions par rapport aux cations de même mobilité aqueuse. Les états fermés sont sélectifs des cations et imperméables à l'ATP et à l'ADP. Les porines mitochondriales semblent être impliquées dans l'apoptose et la libération du cytochrome c. Il existe des preuves émergentes que la membrane cytoplasmique des cellules eucaryotes contient également des porines de la famille des porines eucaryotes avec un rôle dans le métabolisme cellulaire qui n'est pas encore compris.


Que sont les mitochondries et pourquoi sont-elles importantes ?

Chaque être vivant est composé de cellules, qui sont les éléments constitutifs de la vie. À l'intérieur de ces cellules se trouvent une série d'organites – des entités semblables à des sous-compartiments qui remplissent des fonctions diverses mais spécifiques. Différentes cellules de votre corps ont notamment des formes et des tailles différentes, et donc des objectifs différents. Des cellules similaires (celles qui font le même travail) forment des tissus corporels, tels que les muscles, la peau ou le tissu osseux. Des groupes de différents types de cellules constituent les organes de votre corps, tels que votre cœur, votre foie ou vos poumons. Collectivement, tous les organes fonctionnent ensemble comme un système pour vous garder en vie et en bonne santé (Science NetLinks).

Quels sont mitochondries ?

« La centrale électrique de la cellule" c'est ainsi que la plupart des gens pensent et se souviennent des mitochondries (pluriel : mitochondries) de leur cours de biologie au lycée. Ce sont des organelles qui fonctionnent comme des usines microscopiques mais super complexes, produisant de l'énergie et éliminant les déchets nocifs pour le corps. Les mitochondries sont essentielles à la survie des cellules, et l'ATP (énergie) que vos mitrochondries aident à produire est vital pour les processus métaboliques et pour vous maintenir en bonne santé.

La structure des mitochondries

Les mitochondries sont conçues pour maximiser leur productivité. Ils contiennent deux membranes – la membrane externe fonctionne comme une peau et la membrane interne permet à plus de réactions de se produire. Cela signifie que vos cellules peuvent faire plus de travail. Membrane extérieure: Il s'agit d'une bicouche phospholipidique qui comprend des structures à base de protéines appelées porines, qui permettent aux molécules (ions, ATP, ADP, etc.) de se croiser.

Membrane intérieure : Cette membrane est très complexe et c'est là que la plupart de l'ATP est créé. Il comprend tous les complexes du système de transport d'électrons, le complexe ATP synthétase et les protéines de transport. La membrane interne n'a pas de porines comme la membrane externe, elle est donc imperméable à la plupart des molécules.

Crista : Ce sont les plis de la membrane interne, qui augmentent la surface et l'espace disponible pour que les réactions chimiques se produisent. C'est également là que se trouvent la chaîne de transport d'électrons et les enzymes. Le nombre de crêtes dans les mitochondries est en corrélation avec la demande d'ATP de la cellule donnée. Par exemple, les cellules du muscle cardiaque contiennent jusqu'à trois fois plus de crêtes que les autres cellules en raison du plus grand besoin d'ATP (Biology Dictionary).

Matrice: C'est l'espace à l'intérieur de la membrane interne où se déroule le cycle de l'acide citrique, ou cycle de Krebs. C'est une partie importante de la respiration cellulaire et de la production d'ATP. L'ADN mitochondrial est également logé ici.

Comment fonctionnent les puissantes mitochondries

Les mitochondries se trouvent dans les cellules des animaux, des humains, des plantes et des champignons. Alors que les y sont principalement connus pour convertir l'énergie des aliments en énergie pour les processus biologiques, les mitochondries sont profondément impliquées dans plusieurs autres activités qui permettent aux cellules de fonctionner efficacement pour vous aider à garder votre corps en bonne santé. Voici les cinq rôles clés que jouent les mitochondries dans la santé cellulaire, et ce qui peut arriver lorsque ces fonctions sont perturbées :

  1. Production d'ATP Les mitochondries produisent 90 % de l'énergie dont notre corps a besoin pour fonctionner en convertissant l'énergie chimique des nutriments en ATP. Au cours de la respiration cellulaire, un autre produit chimique appelé NADH est produit, qui est ensuite utilisé par les enzymes pour générer de l'ATP sous forme de liaisons chimiques. La production d'ATP est essentielle pour aider le corps à fonctionner correctement. Sans énergie, vos cellules et votre corps souffrent. Un dysfonctionnement dû au manque d'ATP peut contribuer à une variété de problèmes de santé, y compris, mais sans s'y limiter : la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, la maladie de L ou Gehrig, le diabète, le cancer et plusieurs types de maladies mitochondriales.
  2. Homéostasie du calcium — Il s'agit du flux de calcium entrant et sortant des mitochondries d'une cellule. Ce processus est une partie importante de la régulation métabolique et tue les cellules malsaines. Lorsque l'homéostasie du calcium mitochondrial est compromise, différentes conditions pathologiques peuvent survenir, selon le type cellulaire impliqué (NCBI).
  3. Migration cellulaire Cela fait référence au mouvement orchestré des cellules vers des emplacements spécifiques en réponse à des signaux chimiques. La régulation de la migration cellulaire peut aider à éliminer les cellules malsaines et à accélérer la cicatrisation des plaies, à l'inverse, si ce processus n'est pas bien géré, il peut y avoir de graves conséquences pour la santé, y compris, mais sans s'y limiter : la formation de tumeurs et la formation de cancers, les maladies vasculaires, les tumeurs formation et métastase. - Il s'agit essentiellement d'une mort cellulaire programmée qui consiste à maintenir la santé du corps en éliminant les vieilles cellules, les cellules inutiles et les cellules malsaines. Sans apoptose appropriée (trop ou trop peu), il y a un plus grand risque de souffrir de problèmes de santé, y compris des maladies neurodégénératives, des lésions ischémiques, des troubles auto-immuns et de nombreux types de cancer (NCBI) .
  4. L'immunité innée — Cela fait référence à des mécanismes de défense non spécifiques - tels que la peau, les produits chimiques dans le sang et les cellules de votre système immunitaire qui attaquent les cellules étrangères — qui viennent essentiellement à la rescousse immédiatement ou dans les heures suivant l'apparition d'un antigène dans le corps . En plus de réguler la signalisation antivirale, les mitochondries contribuent également à l'activation immunitaire innée à la suite de dommages cellulaires et de stress (NCBI).

Pour récapituler, l'ATP est la devise énergétique de vos cellules, et vos mitochondries sont les principales sources pour en produire davantage pour vous aider à rester en vie et en bonne santé. Ces organites sont également responsables de la surveillance et de l'élimination de la croissance des cellules malsaines. Si une déficience de vos mitochondries est présente, vous êtes plus susceptible de rencontrer des problèmes de santé.


Résultats

Expression de VDAC dans E. coli

Pour rechercher si le E. coli Le complexe Bam peut traiter une protéine mitochondriale -baril, nous avons génétiquement fusionné le VDAC à partir de N. crassa à la séquence signal de la porine bactérienne PhoE pour permettre le transport à travers la membrane interne. En plus de la protéine pleine longueur, deux variantes de VDAC ont été initialement construites pour déterminer si le signal , qui est requis pour l'assemblage des protéines -baril dans l'OM mitochondrial, est également nécessaire pour leur assemblage dans l'OM bactérien. La suppression de deux résidus d'acides aminés de l'extrémité C n'affecte pas le signal identifié par Kutik et al. (2008) et positionne un résidu Phe à l'extrémité C terminale comme dans la séquence de signature OMP bactérienne ( fig. 1). La suppression de cinq résidus affecte le signal et élimine le résidu Phe ( fig. 1). Les constructions générées sont sous le contrôle de la téléphone promoteur, qui permet une expression de haut niveau lorsque les cellules sont cultivées sous Pje limitation. Parce qu'ils sont situés sur un plasmide à copie moyenne, une expression de faible niveau était prévue sous Pje-conditions remplies.

Comparaison des signaux d'assemblage bactériens et mitochondriaux -baril-OMP et des terminaisons C des variantes VDAC utilisées dans cette étude. Un code à une lettre pour les acides aminés est utilisé. X, tout acide aminé φ, résidu hydrophobe π, résidu polaire m, 1 à 28 résidus. Le signal mitochondrial est bordé de traits épais.

Comparaison des signaux d'assemblage bactériens et mitochondriaux -baril-OMP et des terminaisons C des variantes VDAC utilisées dans cette étude. Un code à une lettre pour les acides aminés est utilisé. X, tout acide aminé φ, résidu hydrophobe π, résidu polaire m, 1 à 28 résidus. Le signal mitochondrial est bordé de traits épais.

Cellules de type sauvage E. coli souche MC4100 contenant les plasmides pertinents ont été cultivés dans Pje-le bouillon L complet et les lysats de cellules entières ont été analysés par SDS-PAGE et western blot. L'immunodécoration des transferts a révélé que le VDAC de pleine longueur était exprimé dans ces conditions (fig. 2A). La spécificité de l'antisérum VDAC a été confirmée par l'absence de signal dans la souche portant le vecteur vide (fig. 2A). Après rupture par ultrasons du E. coli cellules, VDAC fractionné avec les membranes comme les porines endogènes OmpF et OmpC, tandis que le chaperon cytoplasmique SecB a été récupéré dans le surnageant (fig. 2A). La suppression de deux résidus de l'extrémité C n'a pas influencé les niveaux de protéines et, comme la protéine de pleine longueur, cette forme mutante a également été récupérée dans la fraction membranaire (fig. 2A). Cependant, la protéine mutante dépourvue de cinq résidus C-terminaux n'a pas été détectée dans ces conditions, peut-être parce que cette variante n'était pas assemblée dans la MO et était donc dégradée protéolytiquement. De même, VDAC n'a pas été détecté lorsqu'il est exprimé sans séquence de signal (fig. 2A). Pour vérifier la dégradation protéolytique de la protéine mutante dépourvue de cinq résidus C-terminaux, le plasmide codant pour cette construction a été introduit dans la souche JW0157, dépourvue de la principale protéase périplasmique DegP, et sa souche parentale isogénique BW25113. Étant donné que la protéine mutante n'a été détectée que dans le degP mutant (fig. 2B), il semble être un substrat pour la protéase périplasmique dans la souche de type sauvage.

VDAC mitochondrial de Neurospora crassa est localisé à l'OM dans Escherichia coli. (UNE) Des lysats de cellules entières, des enveloppes cellulaires et des fractions solubles (surnageant) ont été isolés à partir de cellules MC4100 contenant des plasmides codant pour VDAC (pleine longueur), des variantes tronquées C-terminales manquant de cinq (Δ5 C-term.) ou deux (Δ2 C-term.) .) acides aminés, VDAC sans séquence signal (signal Δ) ou le vecteur vide. Les fractions ont été analysées par SDS-PAGE et western blot à l'aide d'antisérums dirigés contre VDAC, E. coli porines (OmpC/F), ou la protéine cytoplasmique SecB. (B) Cellules entières de E. coli souche BW25113 et ses degP le dérivé mutant JW0157, contenant tous deux des plasmides codant soit pour le VDAC de pleine longueur, soit pour le VDAC mutant dépourvu de cinq résidus C-terminaux, ont été analysés par SDS-PAGE suivi d'un transfert western en utilisant des antisérums dirigés contre VDAC ou OmpA. (C) Les membranes internes et les MO des cellules MC4100 exprimant le VDAC de pleine longueur ont été séparées par centrifugation en gradient de densité de saccharose. Les fractions ont été analysées par SDS-PAGE et western blot en utilisant des antisérums dirigés contre VDAC ou E. coli porines. L'activité NADH-oxydase a été évaluée en tant que marqueur de la membrane interne. Les signaux ou activités pour chaque protéine dans chaque fraction ont été normalisés à la quantité détectée dans la fraction de pic. () Mitochondries isolées de N. crassa (à gauche) et des suspensions d'enveloppes cellulaires de E. coli souche MC4100 exprimant N. crassa Les VDAC (à droite) ont été soit laissés intacts (entrée), digérés avec les concentrations indiquées de protéinase K (PK), soit extraits avec de l'urée 6 M et séparés en une fraction extractible (surnageant) et une fraction membranaire (pastille). Les échantillons ont été soumis à une SDS-PAGE, suivie soit d'une coloration avec du bleu brillant de Coomassie pour détecter les protéines OmpC, OmpF et OmpA, soit d'un western blot en utilisant des anticorps contre VDAC et Tom40. Tom40, OMP mitochondrial avec une boucle accessible aux protéases OmpA, E. coli OMP avec extension périplasmique accessible aux protéases OmpC et OmpF, OMP protégées par les protéases.

VDAC mitochondrial de Neurospora crassa est localisé à l'OM dans Escherichia coli. (UNE) Des lysats de cellules entières, des enveloppes cellulaires et des fractions solubles (surnageant) ont été isolés à partir de cellules MC4100 contenant des plasmides codant pour VDAC (pleine longueur), des variantes tronquées C-terminales manquant de cinq (Δ5 C-term.) ou deux (Δ2 C-term.) .) acides aminés, VDAC sans séquence signal (signal Δ) ou le vecteur vide. Les fractions ont été analysées par SDS-PAGE et western blot à l'aide d'antisérums dirigés contre VDAC, E. coli porines (OmpC/F), ou la protéine cytoplasmique SecB. (B) Cellules entières de E. coli souche BW25113 et ses degP le dérivé mutant JW0157, contenant tous deux des plasmides codant soit pour le VDAC de pleine longueur, soit pour le VDAC mutant dépourvu de cinq résidus C-terminaux, ont été analysés par SDS-PAGE suivi d'un transfert western en utilisant des antisérums dirigés contre VDAC ou OmpA. (C) Les membranes internes et les MO des cellules MC4100 exprimant le VDAC de pleine longueur ont été séparées par centrifugation en gradient de densité de saccharose. Les fractions ont été analysées par SDS-PAGE et western blot en utilisant des antisérums dirigés contre VDAC ou E. coli porines. L'activité NADH-oxydase a été évaluée en tant que marqueur de la membrane interne. Les signaux ou activités pour chaque protéine dans chaque fraction ont été normalisés à la quantité détectée dans la fraction de pic. () Mitochondries isolées de N. crassa (à gauche) et des suspensions d'enveloppes cellulaires de E. coli souche MC4100 exprimant N. crassa Les VDAC (à droite) ont été soit laissés intacts (entrée), digérés avec les concentrations indiquées de protéinase K (PK), soit extraits avec de l'urée 6 M et séparés en une fraction extractible (surnageant) et une fraction membranaire (pastille). Les échantillons ont été soumis à une SDS-PAGE, suivie soit d'une coloration avec du bleu brillant de Coomassie pour détecter les protéines OmpC, OmpF et OmpA, soit d'un western blot en utilisant des anticorps contre VDAC et Tom40. Tom40, OMP mitochondrial avec une boucle accessible aux protéases OmpA, E. coli OMP avec extension périplasmique accessible aux protéases OmpC et OmpF, OMP protégées par les protéases.

Assemblage de VDAC dans l'OM Bactérienne

Nous avons souhaité déterminer dans quelle membrane se situait le VDAC. Pour séparer les membranes internes et les MO, nous avons appliqué des centrifugations en gradient de densité de saccharose. VDAC fractionné avec les protéines marqueurs OM OmpF et OmpC et non avec le marqueur de membrane interne NADH-oxydase ( fig. 2C). Ensuite, nous avons surveillé l'intégration de VDAC dans l'OM dans des expériences de digestion de protéase. Dans son environnement natif, la MO mitochondriale, la protéine est résistante à la protéinase K, alors que la Tom40, qui possède une large boucle exposée à la surface des mitochondries, est dégradée ( fig. 2D). Également dans l'OM bactérienne, le VDAC était largement résistant à la protéinase K, comme les porines endogènes OmpC et OmpF et contrairement à OmpA, qui a un grand domaine exposé au périplasme et a été dégradé dans ces conditions (fig. 2D). De plus, comme les porines bactériennes, le VDAC n'a pas pu être extrait des membranes bactériennes avec de l'urée ( fig. 2D), confirmant qu'il était intégralement inséré dans la MO.

Si le VDAC est effectivement assemblé dans la MO bactérienne, il pourrait être détectable à la surface des cellules bactériennes avec des anticorps spécifiques. L'expression de fond de faible niveau dans les cellules MC4100 non induites était insuffisante pour la détection de VDAC par microscopie par immunofluorescence. Pour augmenter les niveaux d'expression, le plasmide codant pour VDAC a été introduit dans E. coli souche CE1224, qui ne produit pas de porines endogènes. Cultiver les cellules transformées sous Pje la limitation a entraîné une surproduction drastique de VDAC, même à un point tel qu'une petite fraction de protéines précurseurs non transformées a été détectée ( fig. 3A). En microscopie à immunofluorescence, la protéine a été détectée à la surface des cellules bactériennes, comme elle l'était à la surface des mitochondries isolées ( fig. 3B). La spécificité du signal observé a été confirmée par son absence chez les bactéries porteuses du vecteur vide. De plus, la protéine mutante dépourvue de deux résidus d'acides aminés C-terminaux a été détectée à la surface des cellules bactériennes, mais pas celle dépourvue de cinq acides aminés (fig. 3B), bien qu'elle ait été produite en abondance dans ces conditions (fig. 3C). Collectivement, ces résultats indiquent que VDAC s'assemble dans l'OM bactérienne et que l'assemblage dépend du signal .

Détection de VDAC à la surface des cellules bactériennes par microscopie par immunofluorescence. (UNE) Niveaux à l'état d'équilibre de VDAC pleine longueur dans différents Escherichia coli souches utilisées dans cette étude. Escherichia coli la souche CE1224 a été cultivée sous Pje privation, tandis que les souches CE1265 et MC4100 ont été cultivées de façon exponentielle dans du bouillon L. Toutes les souches contenaient le plasmide pJPNcPor1 codant pour le VDAC de pleine longueur sous le contrôle du téléphone promoteur. Des quantités égales de cellules ont été récoltées. Les enveloppes cellulaires ont été isolées, diluées en série et analysées par SDS-PAGE et western blot en utilisant un antisérum contre VDAC. L'accumulation de précurseur non traité (P) contenant la séquence signal est observée dans les cellules CE1224 entièrement induites. (B) Mitochondries isolées de Neurospora crassa ou E. coli Cellules CE1224 exprimant des variants VDAC de pleine longueur ou tronqués en C-terminal, ou portant un vecteur vide, cultivées pendant la nuit sous Pje privation, ont été fixés et immunocolorés avec un antisérum contre VDAC suivi d'un anticorps secondaire conjugué à un fluorophore. Les images ont été acquises dans des canaux de fluorescence (FL) ou de champ clair (BF). (C) Comparaison des niveaux d'expression de VDAC pleine longueur et de la protéine mutante dépourvue de cinq résidus C-terminaux (Δ5 C-term.) dans la souche CE1224 cultivée sous Pje limitation. Des quantités égales de cellules ont été récoltées et analysées par SDS-PAGE et western blot avec un antisérum contre VDAC. P, précurseur et M, forme mature.

Détection de VDAC à la surface des cellules bactériennes par microscopie par immunofluorescence. (UNE) Niveaux à l'état d'équilibre de VDAC pleine longueur dans différents Escherichia coli souches utilisées dans cette étude. Escherichia coli la souche CE1224 a été cultivée sous Pje privation, tandis que les souches CE1265 et MC4100 ont été cultivées de façon exponentielle dans du bouillon L. Toutes les souches contenaient le plasmide pJPNcPor1 codant pour le VDAC de pleine longueur sous le contrôle du téléphone promoteur. Des quantités égales de cellules ont été récoltées. Les enveloppes cellulaires ont été isolées, diluées en série et analysées par SDS-PAGE et western blot en utilisant un antisérum contre VDAC. L'accumulation de précurseur non traité (P) contenant la séquence signal est observée dans les cellules CE1224 entièrement induites. (B) Mitochondries isolées de Neurospora crassa ou E. coli Cellules CE1224 exprimant des variants VDAC de pleine longueur ou tronqués à l'extrémité C, ou portant un vecteur vide, cultivées pendant la nuit sous Pje privation, ont été fixés et immunocolorés avec un antisérum contre VDAC suivi d'un anticorps secondaire conjugué à un fluorophore. Les images ont été acquises dans des canaux de fluorescence (FL) ou de fond clair (BF). (C) Comparaison des niveaux d'expression de VDAC pleine longueur et de la protéine mutante dépourvue de cinq résidus C-terminaux (Δ5 C-term.) dans la souche CE1224 cultivée sous Pje limitation. Des quantités égales de cellules ont été récoltées et analysées par SDS-PAGE et western blot avec un antisérum contre VDAC. P, précurseur et M, forme mature.

Formation de pores par VDAC dans le E. coli OM

Le VDAC est la principale voie par laquelle les métabolites traversent la membrane mitochondriale externe. Ainsi, si le VDAC est correctement assemblé dans la MO bactérienne, il devrait former de gros pores. Pour tester cette possibilité, le plasmide codant pour VDAC a été introduit dans E. coli souche CE1265, qui ne produit pas de porines endogènes. En raison d'une mutation dans le gène régulateur PhoR, cette souche exprime la pho régulon de manière constitutive mais pas dans la même mesure qu'une souche totalement induite comme CE1224 ( fig. 3A). La formation de pores dans la MO a été déterminée dans un test de sensibilité aux antibiotiques dans lequel la zone d'inhibition de croissance autour d'un disque contenant l'antibiotique testé est une mesure de la diffusion de l'antibiotique à travers les pores. Lorsque les bactéries produisaient du VDAC, elles étaient plus sensibles à tous les antibiotiques testés (tableau 1), indiquant que le VDAC forme des pores dans la MO bactérienne. Pour étayer cette conclusion, le clivage de la nitrocéfine par la β-lactamase périplasmique a été mesuré dans des cellules intactes, un processus dans lequel la perméation de cet antibiotique chromogène à travers la MO est limitante. La synthèse de VDAC a entraîné une augmentation drastique du taux de clivage de la nitrocéfine dans les cellules intactes (fig. 4A) compatible avec la formation de pores aqueux dans la MO. Dans les deux tests, l'expression de téléphone du même vecteur a entraîné une augmentation plus modérée de l'absorption d'antibiotiques (tableau 1 et fig. 4A) compatible avec l'observation que le VDAC a une taille de pores considérablement plus grande que le E. coli porines ( Freitag et al. 1982). Collectivement, similaire à son rôle dans les mitochondries, l'intégration de VDAC dans la MO bactérienne favorise le flux de solutés à travers cette membrane.

Expression de VDAC dans Escherichia coli Les cellules augmentent leur sensibilité aux antibiotiques.

Plasmide Zone d'inhibition de croissance (mm)
Éry (25) Ampli (5) Têt (2) Rif (0,3) Vnc (5) Céph (5)
Vecteur 4.0 4.3 3.7 1.0 1.7 2.0
PhoE 6.0 5.7 6.3 2.3 1.0 4.0
VDAC 15.7 16.7 10.7 14.0 12.3 6.3
Plasmide Zone d'inhibition de croissance (mm)
Éry (25) Ampli (5) Têt (2) Rif (0,3) Vnc (5) Céph (5)
Vecteur 4.0 4.3 3.7 1.0 1.7 2.0
PhoE 6.0 5.7 6.3 2.3 1.0 4.0
VDAC 15.7 16.7 10.7 14.0 12.3 6.3

R EMARQUE .—Moins de Porine E. coli la souche CE1265 a été transformée avec un vecteur vide, un plasmide codant pour PhoE, ou un plasmide codant pour VDAC. La sensibilité des cellules transformées aux antibiotiques a été évaluée sur plaques en mesurant la zone d'inhibition de croissance autour de disques filtrants imbibés d'antibiotiques à la concentration indiquée entre parenthèses (en mg/ml). Les valeurs moyennes de la zone d'inhibition de croissance (en mm à partir du bord des disques filtrants) de trois expériences sont indiquées. Ery, érythromycine Amp, ampicilline Tet, tétracycline Rif, rifamycine Vnc, vancomycine et Ceph, céphaloridine.

Expression de VDAC dans Escherichia coli Les cellules augmentent leur sensibilité aux antibiotiques.

Plasmide Zone d'inhibition de croissance (mm)
Éry (25) Ampli (5) Têt (2) Rif (0,3) Vnc (5) Céph (5)
Vecteur 4.0 4.3 3.7 1.0 1.7 2.0
PhoE 6.0 5.7 6.3 2.3 1.0 4.0
VDAC 15.7 16.7 10.7 14.0 12.3 6.3
Plasmide Zone d'inhibition de croissance (mm)
Éry (25) Ampli (5) Têt (2) Rif (0,3) Vnc (5) Céph (5)
Vecteur 4.0 4.3 3.7 1.0 1.7 2.0
PhoE 6.0 5.7 6.3 2.3 1.0 4.0
VDAC 15.7 16.7 10.7 14.0 12.3 6.3

R EMARQUE .—Moins de Porine E. coli la souche CE1265 a été transformée avec un vecteur vide, un plasmide codant pour PhoE, ou un plasmide codant pour VDAC. La sensibilité des cellules transformées aux antibiotiques a été évaluée sur plaques en mesurant la zone d'inhibition de croissance autour de disques filtrants imbibés d'antibiotiques à la concentration indiquée entre parenthèses (en mg/ml). Les valeurs moyennes de la zone d'inhibition de croissance (en mm à partir du bord des disques filtrants) de trois expériences sont indiquées. Ery, érythromycine Amp, ampicilline Tet, tétracycline Rif, rifamycine Vnc, vancomycine et Ceph, céphaloridine.

Le VDAC forme des pores dans la MO bactérienne. (UNE) Des cellules de la souche CE1265 contenant pBR322 codant pour la -lactamase ont été utilisées. Les cellules ont été en outre transformées avec le vecteur vide ou un plasmide codant soit pour PhoE soit pour les variants de VDAC indiqués et incubées avec de la nitrocéfine. Le renouvellement du substrat a été déterminé par spectrophotométrie. (B) Des lysats de cellules entières provenant de cellules utilisées dans des expériences d'absorption de nitrocéfine ont été analysés par SDS-PAGE et western blot en utilisant des anticorps contre les protéines indiquées.

Le VDAC forme des pores dans la MO bactérienne. (UNE) Des cellules de la souche CE1265 contenant pBR322 codant pour la -lactamase ont été utilisées. Les cellules ont en outre été transformées avec le vecteur vide ou un plasmide codant soit pour PhoE soit pour les variants de VDAC indiqués et incubées avec de la nitrocéfine. Le renouvellement du substrat a été déterminé par spectrophotométrie. (B) Des lysats de cellules entières provenant de cellules utilisées dans des expériences d'absorption de nitrocéfine ont été analysés par SDS-PAGE et western blot en utilisant des anticorps contre les protéines indiquées.

Assemblage VDAC dans le E. coli OM dépend du signal

Dans le test d'absorption de nitrocéfine, l'expression du mutant VDAC dépourvu de deux résidus de l'extrémité C a favorisé le clivage de l'antibiotique à des efficacités similaires à celles obtenues lors de l'expression de la protéine de pleine longueur ( fig. 4A), suggérant que cette mutation ne affectent l'assemblage et la formation des pores. En revanche, le clivage de la nitrocéfine était beaucoup moins favorisé par l'expression du variant dépourvu de cinq résidus (figure 4A). Ce dernier variant a pu être détecté dans la souche constitutive CE1265 bien que nettement inférieur à la protéine de pleine longueur (fig. 4B). La protéine était largement dégradée lorsque la fraction d'enveloppe cellulaire de ces cellules était traitée avec de la protéinase K et elle pouvait être extraite de ces membranes avec de l'urée, alors que la protéine pleine longueur produite dans cette souche était résistante à la protéase et non extractible des membranes avec de l'urée. (fig. 5A). Ainsi, il apparaît qu'une grande partie de la protéine mutante détectée n'a pas été insérée dans la MO. Ces polypeptides ne se fractionnent qu'avec les membranes, probablement parce qu'ils forment des agrégats denses qui sont agglomérés avec les membranes pendant la procédure de centrifugation ( Tommassen 1986). Néanmoins, une petite partie des polypeptides était résistante à la protéinase K et n'a pas été extraite avec de l'urée ( fig. 5A) ces polypeptides sont très probablement correctement assemblés dans la MO bactérienne car ils ont facilité dans une certaine mesure la dégradation de la nitrocéfine dans les cellules intactes ( fig. 4A ) compatible avec la formation de pores fonctionnels.

Assemblage VDAC dans le Escherichia coli OM dépend d'un signal β intact. (UNE) La majorité des molécules VDAC dépourvues des cinq résidus C-terminaux ne sont pas correctement intégrées dans l'OM. Enveloppes cellulaires de E. coli souche CE1265 exprimant soit le VDAC pleine longueur (partie supérieure) soit le VDAC mutant (partie inférieure) ont été traités avec la protéinase K (PK) ou extraits avec de l'urée comme décrit dans la légende de la figure 2D et analysés par SDS-PAGE et soit par coloration avec Coomassie Brilliant Blue pour visualiser OmpA ou western blot pour détecter la variante VDAC. (B) Enveloppes cellulaires de E. coli La souche MC4100 exprimant soit le VDAC complet soit la protéine mutante dépourvue de quatre résidus C-terminaux a été extraite avec de l'urée comme décrit dans la légende de la figure 2D et analysée par SDS-PAGE et western blot en utilisant un antisérum contre VDAC.

Assemblage VDAC dans le Escherichia coli OM dépend d'un signal β intact. (UNE) La majorité des molécules VDAC dépourvues des cinq résidus C-terminaux ne sont pas correctement intégrées dans l'OM. Enveloppes cellulaires de E. coli souche CE1265 exprimant soit le VDAC pleine longueur (partie supérieure) soit le VDAC mutant (partie inférieure) ont été traités avec la protéinase K (PK) ou extraits avec de l'urée comme décrit dans la légende de la figure 2D et analysés par SDS-PAGE et soit par coloration with Coomassie Brilliant Blue to visualize OmpA or western blotting to detect the VDAC variant. (B) Cell envelopes of E. coli strain MC4100 expressing either full-length VDAC or the mutant protein lacking four C-terminal residues were extracted with urea as described in the legend to figure 2D and analyzed by SDS-PAGE and western blotting using antiserum against VDAC.

The results presented so far indicated that the mutant protein lacking five C-terminal residues is only very inefficiently incorporated into the E. coli OM, whereas the mutant protein lacking two residues, which still retains an intact β-signal and presents a Phe residue at the C terminus, is assembled as efficiently as is the wild-type VDAC. To investigate whether the presence of a C-terminal Phe could compensate for the disruption of the β-signal, an additional mutant was constructed, which lacks four amino acid residues from the C terminus where it presents a Phe ( fig. 1). In contrast to the mutant protein lacking five C-terminal residues ( fig. 2A), the protein lacking four residues was detected when the construct was expressed in the wild-type E. coli souche. However, when the membrane fraction of this strain was extracted with urea, the mutant protein was partially solubilized, whereas the wild-type protein was insoluble as before ( fig 5B). Therefore, in spite of the presence of a Phe at the C terminus, the mutant protein lacking four C-terminal residues is inefficiently assembled into the E. coli OM. Together, our results are consistent with the notion that an intact β-signal is needed for efficient insertion of VDAC into the bacterial OM but is not absolutely essential for this process.

VDAC Assembly Is Dependent on BamA

To determine whether assembly of VDAC into the OM of E. coli depends on the Bam complex, we made use of a temperature-sensitive (ts) bamA mutant strain ( Doerrler and Raetz 2005). This strain fails to grow at 44 °C, but even at a permissive temperature, it shows an assembly defect of OMPs as evidenced by decreased levels of these proteins. These reduced levels probably result from degradation of misassembled OMPs by periplasmic proteases, such as DegP. The plasmid encoding VDAC was introduced into this mutant strain and into an isogenic strain carrying a wild-type bamA gene, and the bacteria were grown at 32 °C under Pje-limiting conditions to induce VDAC synthesis. Les bamA(ts) mutation did not affect growth under these conditions ( fig. 6A). Like the amounts of correctly assembled endogenous porins and OmpA, the amount of membrane-inserted VDAC was drastically reduced in the bamA(ts) mutant strain ( fig. 6B). In contrast, levels of the periplasmic enzyme alkaline phosphatase (PhoA), the inner–membrane-located enzyme leader peptidase, and the cytoplasmic chaperone SecB in the cell lysates were unaffected ( fig. 6B). Thus, BamA is required for the efficient assembly of VDAC into the bacterial OM.

BamA is required for membrane insertion of VDAC in Escherichia coli. (UNE) Escherichia coli cells containing either a ts allele or wild-type bamA were grown overnight in L-broth at 30 °C. Cells were resuspended at time 0 in Pje-poor medium (LPje) or the same medium supplemented with 660 μM K2HPO4 (HPje) and growth at 32 °C was determined by measuring the optical density at 660 nm. (B) Pje-starved cells containing either the ts bamA allele or the wild-type allele grown in LPje or HPje were harvested after 6 h (arrow in panel A). Cell envelopes were isolated and extracted with 6 M urea to determine the amount of membrane-inserted VDAC and E. coli OMPs. Whole-cell lysates were analyzed to determine the effect of the bamA ts mutation on other proteins. Samples were analyzed by SDS-PAGE, followed either by staining with Coomassie Brilliant Blue to visualize PhoE, OmpC, OmpF, and OmpA or by western blotting using antisera against the following controls: PhoA, periplasmic alkaline phosphatase, which is expressed upon Pje limitation leader peptidase, an inner-membrane protein SecB, a cytoplasmic protein.

BamA is required for membrane insertion of VDAC in Escherichia coli. (UNE) Escherichia coli cells containing either a ts allele or wild-type bamA were grown overnight in L-broth at 30 °C. Cells were resuspended at time 0 in Pje-poor medium (LPje) or the same medium supplemented with 660 μM K2HPO4 (HPje) and growth at 32 °C was determined by measuring the optical density at 660 nm. (B) Pje-starved cells containing either the ts bamA allele or the wild-type allele grown in LPje or HPje were harvested after 6 h (arrow in panel A). Cell envelopes were isolated and extracted with 6 M urea to determine the amount of membrane-inserted VDAC and E. coli OMPs. Whole-cell lysates were analyzed to determine the effect of the bamA ts mutation on other proteins. Samples were analyzed by SDS-PAGE, followed either by staining with Coomassie Brilliant Blue to visualize PhoE, OmpC, OmpF, and OmpA or by western blotting using antisera against the following controls: PhoA, periplasmic alkaline phosphatase, which is expressed upon Pje limitation leader peptidase, an inner-membrane protein SecB, a cytoplasmic protein.


Mitochondria are double-membrane and rods shaped organelles found in the cells of both animals and plants and are responsible for various metabolic functions within the cells. Mitochondria play a vital role in providing the necessary biological energy for the cell through enzymatic oxidation of the substrates of the Krebs&rsquos cycle. The mitochondrion is made up of the outer membrane, inner membrane, intermembrane space, and matrix.

The outer membrane consists of the same amounts of proteins and phospholipids as well as a large number of porins which are specialized proteins. The outer membrane is permeable to ions, nutrients, and energy molecules such as ADP and ATP (Abdrakhimova et al, 2011). The inner membrane of the mitochondrion is complex and consists of a number of folds known as the cristae which are important since it increases the surface area within the organelle. The increased surface area within the organelle coupled with the presence of various proteins within the inner membrane is crucial in aiding various enzymatic reactions including the production of ATP.

However, unlike the outer membrane, the inner membrane is strictly permeable to ATP, Oxygen, and the movement of metabolites across the membrane (Jones, 2013). The space between the outer and the inner membranes is referred to as the intermembrane space and its composition is similar to that of the cytoplasm. The matrix which is the fourth component of the mitochondrion is made up of a complex mixture of enzymes and proteins which are important in the synthesis of the ribosome, ATP, mitochondrial DNA, and tRNAs (Miles et al, 2014).

Succinate dehydrogenase is one of the enzyme complex bound to the inner membrane of the mitochondrion. Succinate dehydrogenase plays a vital role in Krebs&rsquos cycle since it catalyzes the oxidation of Succinate to fumarate within the inner membrane (Gorbacheva et al, 2013).


How do proteins enter mitochondria?

If the inner membrane is so impermeable, how do proteins enter?

The outer membrane of the mitochondria contains the protein "porin". This forms an aqueous channel through which proteins up to 10,000 daltons can pass and go into the intermembrane space. Indeed, the small molecules actually equilibrate between the outer membrane and the cytosol. However, most proteins cannot get into the matrix unless they pass through the inner membrane. This membrane contains cardiolipin which renders it virtually impermeable. This requires transport mechanisms across the membrane that are more organized and regulated. A very simple view of the process is diagrammed in this cartoon.

This figure is taken from Alberts et al, Molecular Biology of the Cell, Garland Publishing, N.Y. 1994, Third Edition

Transport across the mitochondrial membranes requires the concerted action of a number of translocation machineries. The machinery in the outer membrane is called the Tom complex (Translocator outer membrane) and that for the inner membrane is called the Tim complex (Translocator jenner Membrane). Proteins that have to go all the way to the matrix have an NH2 cleavable signal sequence (see the above cartoon).

Most proteins must be uncoiled or stretched out to go through the translocators. This involves ATP binding and is monitored and stabilized by a chaperone proteins, including hsp70. Thus, before the protein can go through Tom complex, it must become "translocation competent".

Transport through the outer membrane: characteristics of Tom complex.

Not surprisingly, the TOM complex will include import receptors that initially recognize the signal peptide or a signal sequence (these include Tom20, Tom22, and Tom70). Different proteins use different receptors. In the above cartoon, the receptor is represented as a blue oval in which the signal peptide is inserted. The receptors then bring the protein to the region containing the translocator proteins. This is actually a complex of proteins.
It is called the General Import Pore (GIP) and it facilitates the translocation of the presequence of the protein across the outer membrane. (the GIP is made of Tom40, Tom5, Tom 6, and Tom7). Tom40 appears to be the core element of the pore and forms oligomers. It traverses the membrane as a series of 14 anti-parallel beta strands which form a beta barrel. It also interacts with polypeptide chains passing through the pore. All of the other Tom components in GIP are anchored to the outer membrane by helical transmembrane segments (hydrophobic anchors).

Recent study of Tom40: Rapaport, D and Neupert W, Biogenesis of Tom40, Core Component of the TOM complex of mitochondria. J Cell Biol 146 321-332, 1999. Study looked at how Tom40 entered outer membrane and became a part of the GIP. The study reported that:

  • First, as with many mitochondrial proteins, Tom40 requires cytosolic chaperones to prepare it for entry. In the case of this protein, becoming "translocation competent" requires ATP and a partially folded state (the latter is mediated by the cytosolic chaperone (hsp70).
  • Second, when it is "competent", it interacts with the surface receptor, Tom20. There is no cleavable signal peptide however, the experiments showing the requirement for partial folding suggests targeting information is found in discontinuous sites brought together in the folded domain.
  • Final insertion is into preexisting Tom complexes. This requires an intact N terminus.
  • Dimerization occurs after entry into the membrane.

Characteristics of Tim Complexes

Mitochondrial proteins destined for the matrix often have a cleavable signal peptide on the protein which must be recognized before it will be admitted through the mitochondrial translocator. These proteins with "amino terminal signals" (your text), or "preproteins" or "presequences" (current literature) usually interact with Tom20 first. Then, they have to get through the outer membrane. To do that, they are transferred to the GIP complex: First, they interact with Tom22 and Tom5 which ushers them to the pore formed by Tom40. They then enter the matrix using the pore complex made of Tim23 and Tim17 which are in the inner membrane. Also, very important, their entry is dependent on membrane potential. This is set up by the electron transport complexes. Recall that hydrogen ions are being pumped into the intermembrane space creating a charge gradient that is more negative on the matrix site. This membrane potential actually helps pulls the protein into the Tim23-Tim17 channels. The protein then enters the matrix where the cleavable preprotein is clipped off by a protease, MPP. mt- hsp 70 in the matrix works with Tim44 to complete the full transfer to the matrix. mthsp70 and Tim 44 actually "pull" the protein into the matrix by a process that requires ATP. It also requires the membrane potential set up by the electron transport chain.

Some mitochondrial proteins destined for the inner membrane have a cleavable presequence followed by one or more hydrophobic membrane-spanning segments that function as stop-transfer sequences in the IM or, serve to insert the polypeptide into the IM after it gets in the matrix. These are like the Type I membrane proteins described in the unit on the rough endoplasmic reticulum.

However, other proteins do not have a cleavable targeting signal (Types II and III). Mitochondrial proteins that have an internal signal sequence (examples include a number of proteins in the inner membrane) generally interact with Tom70 as the receptor. Then, after they transit the outer membrane via the GIP complex, they enter the special Tim pathway. This may involve interactions with small Tim's of the intermembrane space and Tim22-Tim54 of the inner membrane itself.

Those proteins that do not have a cleavable targeting signal sequence often have signals with the following characteristics: They are often a stretch of positively charged amino acids (sometimes adjacent to a membrane spanning hydrophobic region). Sometimes these form loops that face the matrix. Recall the "positive inside rule" has positively charged amino acids concentrated at the cytosolic side for proteins being inserted into the rough endoplasmic reticulum. These mitochondrial proteins tend to follow this rule, only the matrix becomes the site where the positive charges are most numerous.

Examples from the literature:

Davis, AJ, Ryan, KR, and Jensen, RE Tim23p contains separate and distinct signals for targeting to mitochondria and insertion in to the inner membrane. Molecular Biology of the Cell 9: 2577-2593 (1999).

  • Tim23 is one of the inner membrane translocator proteins. It does not have an amino-terminal presequence. Targeting information is found within the mature protein.
  • Tim23 has 4 transmembrane segments and two positively charged loops facing the matrix. What is needed for signalling an import?
  • Replaced positively charged amino acids in one or both loops with alanine residues.
  • At least one of these loops is required for insertion into the inner membrane.
  • The signal for targeting to mitochondria is found in at least two of the hydrophobic transmembrane segments.

Kurz, M, Martin, H, Rassow J, Pfanner, N, and Ryan, MT. Biogenesis of Tim proteins of the mitochondrial carrier import pathway: differential targeting mechanisms and crossing over with the main import pathway. Molecular Biology of the Cell 10: 2461-2474 (1999). Compared the route and binding of three Tim proteins

  • Tim54 carries a amino terminal, noncleaved translocation sequence that is positively charged. However, it prefers to use Tom70 as its receptor instead of Tom20. After moving through the GIP, it uses its positively charged amino terminal sequence to enter the matrix. It required chaperones and ATP to get to the matrix.
  • Tim22 is a hydrophobic protein that uses Tom20 for targeting to the OM. Then it follows the Tim route for carrier proteins, like Tim23. It does not require hsp70 or ATP for entry.
  • Small Tims are normally found in the intermembrane space and are not membrane proteins. They used Tom20 for their receptor and transfer to the GIP complex. However, when Tom20 was destroyed by trypsin, leaving only Tom5, the small Tims were able to enter.

The above cartoon from your text shows more ways that proteins can be inserted into inner and outer membranes, once they are recognized by the receptors. As shown by proteins in the literature examples above, the mitochondria uses both positively charged signals as well as membrane spanning hydrophobic sequences to translocate and then reach their final destination. As in the above examples, there can be multiple signal and insertion sites. However, the distribution of the charged amino acids helps orient the protein so that the positive charges are in the matrix. This is how the cytochromes in the respiratory chain or the elementary particles are inserted by mitochondrial actions.

This figure is taken from Alberts et al, Molecular Biology of the Cell, Garland Publishing, N.Y. 1994, Third Edition

The following figure is from another text by Lodish et al, Molecular Cell Biology. It shows the entire sequence of events required to take a protein into the matrix.

  • Step 1: Protein unfolds as it binds to hsp70 chaperone. Red positive area indicates targeting sequence. Chaperone binding is ATP dependent.
  • Step 2: Targeting sequence binds to receptor (usually Tom20)
  • Step 3. Receptor ushers protein to site of translocator. Other Tom proteins involved, but Tom40 is the core of the translocator channel.
  • Step 4: Protein is translocated stimulated by the membrane potential. Electron transport complexes on inner membrane have pumped H+ across to the intermembrane space, leaving the matrix more negative. This attracts the protein (the signal is positively charged). Protein moves through Tim translocators. Tim 44 and hsp70 in the matrix continue to guide and pull the protein through the pore. An ATP requiring process.
  • Step 5. another chaperone (called a chaperonin), hsp60 causes the folding of the the protein into its tertiary sequence. Also an ATP requiring process.
  • Step 6. Presequence is cleaved in the matrix.

What happens if an import protein is defective?

Studies of yeast have helped us learn about the receptor and translocation machinery contains a complex of proteins that work together to allow entry. In yeast, these have been named the MOMX. series, where the number designates the protein number. An important protein in the recognition of the signal peptide and its binding to the receptor is called "MOM19". MOM 19 works with MOM 72 to recognize and bind the proteins. Then MOM22 helps the protein to pass from the receptor binding site to the insertion point at the outer membrane. The importance of MOM19 can be proved by adding antibodies to MOM19 and blocking import.

In a recent paper by Harkness et al (J Cell Biology 124: 637-648, 1995), they created mutant yeast cells that included a defective gene for MOM19.

They also included a drug resistant marker so they could selectively grow cells with the mutant gene (in the presence of the drug, p=fluorophenyl alanine, or fpa). So, the longer the cells grow in the drug, the more drug-resistant mutant cells will be found. The above electron micrographs are from their paper (cited above). They show the result of the absent MOM19 protein. What is absent in the cells grown for 16 or 32 h in the drug?

When they did the assays for the proteins, what proteins were actually missing? Tests showed that there was a dramatic decrease in most of the respiratory chain (electron transport chain) including cytochromes a/a3, and b. However, cytochrome C was unaffected. This suggests that another protein must control its import.


Centrifugation différentielle

Differential centrifugation is the most common method of fractionating cell. Fractionation is separation of different organelles within a cell. It is a classical procedure used to isolate different particles by stepwise successive centrifugations at increasing RCF's (Relative Centrifugal Forces).
Centrifugation separates particles in a suspension based on differences in size, shape and density that together define their sedimentation coefficient. The tube containing the suspension of particles is rotated at a high speed, which exerts a centrifugal force directed from the center of the rotor towards the bottom of the tube. Centrifugal Force 'G' is more commonly expressed as the Relative Centrifugal Force (RCF) or g value in multiples of the earth's gravitational field 'g'.

Relative centrifugal force or g value is calculated using the following formula:

RCF =Relative Centrifugal Force,
r = radius in centimeter,
Q = revolutions per minute.

Thus depending on the radius of centrifuge being used the Q value will vary for different centrifuge to obtain the same g value. When doing differential centrifugation, density of the liquid in which the centrifugation is carried out should be uniform and its density must be far lower than that of the particles to be separated. The viscosity of the particles should also be very low. As a consequence, the rate of particle sedimentation depends on its size and the applied g force. Differential centrifugation gives a crude resolution of sub cellular fraction. This centrifugation is usually carried out using fixed angle rotor.


Mitochondria: Structure and Functions

Mitochondries are known as the powerhouses de la cellule. Elles sont organites that act like a digestive system that takes in nutrients, breaks them down, and creates energy-rich molecules for the cell. The biochemical processes of the cell are known as respiration cellulaire. Many of the reactions involved in cellular respiration happen in the mitochondria. They are the working organelles that keep the cell full of energy.

There are small organelles floating free throughout the cell. Some cells have several thousand mitochondria while others have none. Muscle cells need a lot of energy so they have loads of mitochondria. Neurons (cells that transmit nerve impulses) don’t need as many. If a cell feels it is not getting enough energy to survive, more mitochondria can be created. Sometimes it can grow larger or combine with other mitochondria. It all depends on the needs of the cell.


Metabolons and Supramolecular Enzyme Assemblies

Kendrick B. Turner , . Scott A. Walper , in Methods in Enzymology , 2019

2.2.1.2 Cultivation conditions

Cultivation conditions as described in Section 2.1.1.2 can be followed until the induction of expression (steps 1–4). The subsequent protocols are based on the protein–protein packaging strategy described by Alves et al. that employs a SpyTagged-porin protein (OmpA-ST) and a SpyCatcher-labeled phosphotriesterase enzyme (PTE-SC) ( Alves et al., 2018 Alves, Turner, Medintz, et al., 2016 Zakeri et al., 2012 ). The methods below are based on a two vector expression system in which the anchor protein (OmpA-ST) is under the control of an arabinose-inducible promoter, and the enzyme (PTE-SC) is regulated using a T7 promoter. Expression of the T7 polymerase is itself regulated by a lactose-inducible promoter.

After the culture reaches an OD600 = 0.8 add l -arabinose (0.02%–1% final concentration v/v) to induce expression of the PTE-SC construct under the control of the arabinose inducible promoter.

Incubate an additional 2 h at 37°C.

Induce expression of the OmpA-ST anchor by adding the lactose analog Isopropyl β- d -1-thiogalactopyranoside (IPTG) to a final concentration of 0.5 mM.



Commentaires:

  1. Shaktile

    Il me semble que tu te trompes

  2. Shipley

    Je vais mieux, peut-être que je garderai le silence

  3. Tyson

    Quelque chose à la mode de nos jours.

  4. Jorian

    De quoi devrait-il?



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