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Inactivation insertionnelle à l'aide de pBR322

Inactivation insertionnelle à l'aide de pBR322


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J'ai des questions concernant la "sélection utilisant l'inactivation insertionnelle".

Dans une expérience typique de recombinaison d'ADN utilisant le plasmide pBR322 où un nouveau gène est inséré à la place de tet gène, il est dit que les entités avec le plasmide recombinant peuvent être sélectionnées en faisant croître toutes les bactéries dans deux milieux différents : un avec de la tétracycline et un avec de l'ampicilline.

Je sais que pBR322 contient deux gènes qui le rendent résistant à la fois à la tétracycline et à l'ampicilline, et aussi que le plasmide nouvellement créé ne sera résistant qu'à l'ampicilline, puisque son tet gène n'est plus fonctionnel.

Ainsi, dans la plaque avec la tétracycline, seules les entités avec le plasmide d'origine se développeront. Dans la plaque avec de l'ampicilline, cependant, les entités avec le plasmide d'origine et le plasmide modifié se développeront.

Comment cela peut-il être une sélection alors que deux types d'entités différents poussent dans une même assiette ?

Est-ce que je comprends mal le sens de « sélection » dans ce cas ?

Mon explication ci-dessus semble très immature, donc ce serait formidable si quelqu'un peut me fournir une compréhension plus profonde.


La plaque d'ampicilline sélectionne les bactéries transformées avec le plasmide, soit l'original ou recombinant, tandis que la plaque de tétracycline sélectionne uniquement les bactéries transformées avec le plasmide d'origine. Étant donné que vous n'êtes intéressé que par le plasmide recombinant, vous devez effectuer une forme de placage de répliques et comparer les deux plaques pour en déduire quelles colonies contiennent le plasmide recombinant (celles qui poussent sur l'ampicilline mais pas sur la tétracycline).


  • Les transposons contiennent des signaux pour tronquer l'expression d'un gène interrompu, l'inactivant ainsi.
  • Les transposons sont des outils largement utilisés en biologie, fréquemment utilisés pour la mutagenèse par insertion, les études de rupture de gènes à grande échelle et le marquage de gènes.
  • Les expériences de perturbation génique médiée par le transposon et les pièges à promoteur reposent sur une insertion non dirigée, non dirigée et pseudo-aléatoire du transposon.
  • transposable: Capable d'être transposé (dans n'importe quel sens).
  • plasmide: Un cercle d'ADN double brin séparé des chromosomes, que l'on trouve dans les bactéries et les protozoaires.

Un élément transposable (TE) est une séquence d'ADN qui peut changer sa position relative (auto-transposition) dans le génome d'une seule cellule. Le mécanisme de transposition peut être soit &ldquocopy and paste&rdquo soit &ldquocut and paste. &rdquo La transposition peut créer des mutations phénotypiquement significatives et modifier la taille du génome cellulaire. La découverte de ces gènes du saut par Barbara McClintock au début de sa carrière lui a valu un prix Nobel en 1983.

Les transposons dans les bactéries portent généralement un gène supplémentaire pour une fonction autre que la transposition et la résistance aux antibiotiques. Chez les bactéries, les transposons peuvent passer de l'ADN chromosomique à l'ADN plasmidique et inversement, permettant le transfert et l'ajout permanent de gènes tels que ceux codant pour la résistance aux antibiotiques (des souches bactériennes multirésistantes peuvent ainsi être générées). Lorsque les éléments transposables manquent de gènes supplémentaires, ils sont appelés séquences d'insertion. Les transposons sont des séquences d'ADN semi-parasitaires qui peuvent se répliquer et se propager à travers le génome de l'hôte. Ils peuvent être exploités comme un outil génétique pour l'analyse de la fonction des gènes et des protéines. L'utilisation de transposons est bien développée chez la drosophile (où les éléments P sont le plus couramment utilisés) et chez le cresson de Thale (Arabidopsis thaliana) et des bactéries telles que Escherichia coli (E. coli).

Les systèmes de transposons d'ADN synthétique sont construits pour introduire des séquences d'ADN définies avec précision dans les chromosomes d'animaux vertébrés dans le but d'introduire de nouveaux traits et de découvrir de nouveaux gènes et leurs fonctions (par exemple en établissant un phénotype de perte de fonction ou une inactivation de gène). La transposition est un processus précis dans lequel un segment d'ADN défini est excisé d'une molécule d'ADN et déplacé vers un autre site dans la même molécule d'ADN ou le génome.

Chiffre: Système de transposons: Les applications du système de transposon de la belle au bois dormant.


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2e PUC Biologie Biotechnologie : Principes et processus Questions et réponses One Mark

Question 1.
Les cellules eucaryotes ont-elles des endonucléases de restriction ? Justifiez votre réponse.
Réponse:
Les cellules eucaryotes n'ont pas d'endonucléases de restriction. Les cellules eucaryotes ont d'autres moyens de défense, c'est-à-dire le système immunitaire) contre l'infection virale.

Question 2.
Quelles sont les cellules hôtes couramment utilisées en génie génétique ?
Réponse:
E. coli.

Question 3.
Quels sont les vecteurs couramment utilisés pour le clonage de gènes chez les plantes ?
Réponse:
Tiplasmide présent chez Agrobacterium tumefaciens.

Question 4.
Qui a découvert la technique de la PCR ?
Réponse:
Kary Mullis.

Question 5.
Qu'est-ce qu'un bioréacteur ?
Réponse:
Il s'agit d'une installation d'ingénierie conçue pour effectuer des réactions biologiques dans des conditions aseptiques.

Question 6.
Nommez la technique par laquelle les fragments d'ADN peuvent être séparés ?
Réponse:
Électrophorèse sur gel.

Question 7.
Nommer la source de la Taq polymérase ?
Réponse:
Thermus aquaticus.

Question 8.
Que sont les protéines recombinantes ?
Réponse:
Les protéines produites à partir d'un ADN recombinant ou d'un organisme transgénique sont des protéines recombinantes.

Question 9.
Nommez le vecteur couramment utilisé pour la transformation dans les cellules végétales ?
Réponse:
Agrobacterium tumefacien.

Question 10.
Qui a isolé l'enzyme de restriction pour la première fois ?
Réponse:
Warner Arber et Hamilton Smith.

Question 11.
Définir un brevet ?
Réponse:
Le brevet est la protection gouvernementale à l'inventeur du matériel biologique, lui garantissant pour un temps déterminé le droit exclusif de fabriquer, d'exploiter, d'utiliser et de vendre une invention.

Question 12.
Définissez le terme plasmide.
Réponse:
ADN extrachromosomique circulaire à réplication autonome (ou) ADN extrachromosomique circulaire double brin, présent dans le cytoplasme des bactéries.

Question 13.
Définir la biotechnologie.
Réponse:
L'intégration des sciences naturelles et des organismes, des cellules, des parties de celles-ci et des analogues moléculaires pour les produits et services est connue sous le nom de biotechnologie.

Question 14.
Nommez le composé utilisé pour visualiser l'ADN sous rayonnement UV.
Réponse:
Le bromure d'éthidium.

2e PUC Biologie Biotechnologie : Principes et processus Questions et réponses à deux notes

Question 1.
Décrivez brièvement les éléments suivants :
(a) Origine de la réplication
(b) Bioréacteurs
(c) Traitement en aval.
Réponse:
(a) Origine de la réplication : il s'agit de la séquence dans la molécule d'ADN, d'où commence la réplication et tout morceau d'ADN lorsqu'il est lié à cette séquence peut être amené à se répliquer dans la cellule hôte.

(b) Bioréacteurs : Ce sont des récipients de culture dans lesquels un grand volume (100-1000 litres) de culture peut être traité pour obtenir une grande quantité d'un produit à l'échelle commerciale.

(c) Traitement en aval : après la formation, un produit subit certains processus avant qu'un produit fini ne soit prêt à être commercialisé. Ces processus comprennent la séparation et la purification qui sont collectivement appelées traitement en aval.

Question 2.
Expliquer brièvement:
(a) PCR
(b) Enzymes de restriction et ADN
(c) Chitinase
Réponse:
(a) PCR : PCR signifie Polymerase Chain Reaction. Dans cette réaction, plusieurs copies du gène (ou ADN) d'intérêt sont synthétisées in vitro, en utilisant des ensembles d'amorces et l'enzyme Taq ADN polymérase.

(b) Enzymes de restriction et ADN : Ce sont les enzymes qui restreignent la croissance des bactériophages. Ces enzymes sont présentes dans de nombreuses bactéries où elles fonctionnent dans le cadre de leur mécanisme de défense appelé système de modification de restriction. Les enzymes de restriction sont de deux types :
(a) L'endonucléase de restriction coupe l'ADN en morceaux.
(b) L'enzyme de modification ajoute un groupe méthyle à l'ADN.

(c) Chitinase: C'est une enzyme qui décompose la substance chitineuse présente dans la paroi des champignons.

Question 3.
Discutez avec votre professeur et découvrez comment faire la distinction entre les éléments suivants :
(a) ADN plasmidique et ADN chromosomique
(b) ARN et ADN
(c) Exonucléase et endonucléase.
Réponse:
(a) ADN plasmidique et ADN chromosomique: L'ADN plasmidique est un petit ADN circulaire double brin présent dans certaines bactéries. Ils portent des gènes de résistance aux médicaments, de fixation de N2 et de fertilité. L'ADN chromosomique est beaucoup plus gros et porte des gènes pour d'autres traits de la cellule.

(b) ARN et ADN: l'ARN est un polymère simple brin de ribonucléotides, qui contiennent du sucre ribose et de l'adénine, de la guanine, de la cytosine et des bases azotées d'uracile, tandis que l'ADN est un polymère double brin de désoxyribonucléotides contenant du sucre désoxyribose et de l'adénine, de la guanine, de la cytosine. et les bases azotées de la thymine.

(c) Exonucléase et endonucléase: Les exonucléases éliminent les nucléotides des extrémités de l'ADN, tandis que les endonucléases effectuent des coupes à des positions spécifiques dans l'ADN.

Question 4.
Mentionnez les outils utilisés dans la technologie de l'ADN recombinant.
Réponse:
Gène souhaité, ADN vecteur, enzymes, cellule hôte et bioréacteur.

Question 5.
Que sont les séquences palindromiques ? Donne un exemple.
Réponse:
Dans une molécule d'ADN double brin, si les deux brins d'une région sont identiques lorsqu'ils sont lus à la fois vers l'avant et vers l'arrière, ils sont appelés séquences palindromiques.

Question 6.
Comment les endonucléases de restriction sont-elles nommées ?
Réponse:
La dénomination des endonucléases de restriction est basée sur les règles suivantes :

  • La première lettre du REN fait référence au nom de genre de la bactérie dont il est issu et écrit en majuscules.
  • Les deuxième et troisième lettres font référence au nom de l'espèce de la bactérie dont il est dérivé et sont écrits en minuscule.
  • Si une quatrième lettre est présente, elle représente le nom de la souche ou de la sous-espèce bactérienne.
  • Le nombre romain indique les différents REN dérivés du même organisme.
    Ex. : Hind III.

Question 7.
Que sont les ciseaux moléculaires ? Expliquez leur rôle.
Réponse:
Les enzymes nucléaires qui cassent l'ADN à des sites spécifiques sont appelées endonucléases de restriction [REN]. Les REN sont communément appelés ciseaux biomoléculaires. REN peut couper les deux brins d'un ADN à la même position ou à des positions différentes,
par exemple : Eco RI, Hind III, Sal I, Bam I.

Question 8.
Dessinez un diagramme étiqueté soigné du plasmide pBR322
Réponse:

Question 9.
Écrire les applications de la technique PCR.
Réponse:

  • Pour amplifier des brins d'ADN et d'ARN.
  • Étudier l'orientation et la localisation des fragments de restriction les uns par rapport aux autres.
  • Détection de mutations/présence de gènes mutés dans les chromosomes.
  • Pour identifier les empreintes digitales d'ADN.

Question 10.
Que sont les nucléases ? Distinguer exonucléases et endonucléases.
Réponse:
Les enzymes de restriction sont les nucléases. Ils sont de deux types à savoir les exonucléases et
endonucléases.

Les exonucléases éliminent les nucléotides des extrémités de l'ADN et les endonucléases peuvent couper à des points spécifiques dans l'ADN lui-même

Question 11.
Dessinez un diagramme étiqueté soigné du bio-réacteur à réservoir agité.
Réponse:

Question 12.
Que sont les « marqueurs sélectionnables » ? Quelle est leur utilisation en génie génétique ?
Réponse:
Un marqueur sélectionnable est un gène qui aide à sélectionner les cellules hôtes qui contiennent le vecteur et à éliminer les non-transformants, par ex. les gènes codant pour la résistance aux antibiotiques sont des marqueurs sélectionnables utiles car ils permettent uniquement la croissance sélective des transformants.

Question 13.
Qu'est-ce que « l'inactivation insertionnelle » ?
Réponse:
Si un ADN recombinant est inséré dans la séquence codante de l'enzyme B – galactosidase, il en résulte l'inactivation de l'enzyme qui est appelée « inactivation insertionnelle ». La présence de substrat chromogène donne des colonies de couleur bleue si le plasmide dans la bactérie n'a pas d'insert. La présence d'insert entraîne une inactivation insertionnelle et les colonies ne produisent aucune couleur.

Question 14.
Dessinez un diagramme étiqueté soigné du bioréacteur à réservoir agité barboté.
Réponse:

Question 15.
Que sont les bioréacteurs ? Nommez le bioréacteur le plus couramment utilisé en génie génétique.
Réponse:
Il s'agit d'une installation d'ingénierie conçue pour effectuer des réactions biologiques dans des conditions aseptiques.

2e PUC Biologie Biotechnologie : Principes et processus Questions et réponses à trois points

Question 1.
Quelles sont les deux techniques de base impliquées dans la biotechnologie moderne ?
Réponse:
Les deux techniques de base impliquées dans la biotechnologie moderne sont
(a) Génie génétique qui est la technique consistant à modifier la nature du matériel génétique ou à l'introduire dans un autre organisme hôte pour modifier son phénotype.

(b) Techniques pour faciliter la croissance et la multiplication des seuls microbes ou cellules souhaités en grand nombre dans des conditions stériles pour la fabrication.

Question 2.
Que sont les organismes génétiquement modifiés ? Nommez deux facteurs dont dépend leur comportement ?
Réponse:
Les organismes dont les gènes ont été modifiés par manipulation sont appelés organismes génétiquement modifiés ou organismes transgéniques. Les deux facteurs dont dépend leur comportement sont :

  • insertion correcte du gène d'intérêt.
  • récolte appropriée d'organismes génétiquement modifiés pour produire le produit souhaité.

Question 3.
Qu'entendez-vous par « biopiraterie » ? Donnez un exemple ?
Réponse:
La biopiraterie fait référence à l'utilisation de bio-ressources par des sociétés multinationales et d'autres organisations sans autorisations appropriées des pays et des personnes concernées, par exemple. Le riz basmati cultivé en Inde se distingue par sa saveur et son arôme uniques, mais une société américaine a obtenu des droits de brevet sur le basmati par le biais d'un brevet américain.

2e PUC Biologie Biotechnologie : Principes et processus Questions et réponses en cinq points

Question 1.
Expliquer le processus de la technologie de l'ADN recombinant.
Réponse:
Processus de génie génétique :
(a) Isolement du matériel génétique (ADN) : Dans la technologie de l'ADN recombinant, il est essentiel d'isoler l'ADN sous une forme pure exempte d'autres macromolécules. Étant donné que la molécule d'ADN est enfermée dans la membrane de la cellule, nous devons ouvrir la cellule pour libérer l'ADN ainsi que d'autres macromolécules comme l'ARN, les protéines, les polysaccharides et les lipides. Ceci est effectué dans les cellules bactériennes, les cellules végétales et animales avec certaines enzymes.

Les autres macromolécules peuvent être éliminées par un traitement approprié avec des enzymes spécifiques. Enfin, les molécules d'ADN purifiées sont précipitées après l'ajout d'éthanol réfrigéré et cela peut être vu comme une collection de fils fins dans la suspension.

(b) Coupure de l'ADN à des emplacements spécifiques : La molécule d'ADN purifiée isolée est coupée (clivée) à l'aide d'une enzyme appropriée appelée endonucléase de restriction, en segments avec des extrémités collantes.

(c) Electrophorèse sur gel : Les fragments d'ADN coupés sont séparés par électrophorèse sur gel en utilisant un gel d'agarose. L'ADN est une molécule chargée négativement, il se déplace donc vers l'électrode positive (anode).

(d) Amplification du gène d'intérêt par PCR : l'amplification du gène est « un processus consistant à faire de nombreuses copies d'un gène ». Il est obtenu en utilisant une technique appelée réaction en chaîne par polymérase (PCR).

Procédure de PCR :
1. L'ADN du segment souhaité à amplifier, un excès des deux molécules d'amorce, les quatre désoxyribose triphosphates et l'ADN polymérase sont mélangés ensemble dans un mélange réactionnel dans un tube eppendorf avec des quantités suffisantes de Mg++. Le tube eppendorf est placé dans l'unité PCR et les opérations suivantes sont effectuées séquentiellement.

2. Dénaturation : Le mélange réactionnel est d'abord soumis à une température comprise entre 90 – 98°C (généralement 94°C). Il en résulte la séparation de deux brins d'ADN en raison de la rupture des liaisons hydrogène. C'est ce qu'on appelle la dénaturation. Chaque brin d'ADN agit comme un brin matrice pour la synthèse d'ADN. La durée de cette étape dans le premier cycle de PCR est généralement de 2 minutes à 94°C.

3. Recuit (recuit = assemblage) : Le mélange est maintenant refroidi à basse température (40-60°C). Au cours de cette étape, deux amorces oligonucléotidiques, complémentaires d'une région d'ADN, s'hybrident (s'hybrident) une à chaque extrémité 3 du brin d'ADN. La durée de l'étape de recuit est généralement d'une minute pendant le premier ainsi que les cycles suivants de PCR.

4. Extension d'amorce : Au cours de cette étape, l'enzyme taq ADN polymérase étend les amorces à l'aide de nucléotides et de matrices d'ADN. Les deux amorces s'étendent l'une vers l'autre afin d'obtenir deux nouveaux brins d'ADN (en 5). La durée d'extension de l'amorce est généralement de 2 minutes à 72°C. Le fragment amplifié si nécessaire peut maintenant être utilisé pour ligaturer avec le vecteur pour un clonage ultérieur. La taq ADN polymérase reste active pendant la dénaturation induite à haute température de l'ADN double brin.

(e) Insertion d'ADN recombinant dans l'hôte :
1. Electroporation : La cellule bactérienne est placée dans une solution avec du CaCl froid2 solution puis en les plaçant à 42°C par intermittence. Il en résulte le développement de pores dans la membrane cellulaire. Maintenant, le plasmide recombinant migre dans la cellule hôte et la cellule bactérienne se transforme.

2. Microinjection : c'est l'injection directe d'un gène souhaité dans le noyau d'une cellule animale par microseringue.

3. Biolistique : Ici, une cellule végétale appropriée est bombardée de microparticules à grande vitesse (2 à 2 mm) d'or ou de tungstène recouvertes d'ADN afin d'introduire l'ADN dans la cellule.

(f) Obtention du produit du gène étranger :

  • Le transgène s'exprime sous forme de protéine(s) dans des conditions appropriées.
  • Le ou les produits peuvent être extraits du milieu en utilisant une procédure appropriée.
  • Les cellules transgéniques peuvent être cultivées en laboratoire pour obtenir le produit transgénique à petite échelle.
  • Les cellules transgéniques peuvent également être cultivées/multipliées dans un système de culture en continu, dans lequel le milieu utilisé est drainé d'un côté et du milieu frais est ajouté de l'autre côté pour la production d'une biomasse plus importante et du produit souhaité.
  • Les bioréacteurs sont utilisés pour traiter de grands volumes de culture pour obtenir le produit d'intérêt en quantité suffisante à l'échelle commerciale.

(g) Traitement en aval : les produits formés dans un bioréacteur doivent être soumis à une série de processus avant d'être prêts à être commercialisés en tant que produits finis.
Les différents procédés utilisés pour la récupération des produits utiles sont appelés collectivement traitements en aval. Les processus comprennent la séparation et la purification du produit, l'ajout de conservateurs appropriés et un contrôle de qualité rigoureux, etc. Une telle formulation doit subir des essais cliniques stricts comme dans le cas des médicaments. Ces tests de contrôle qualité et essais cliniques varient d'un produit à l'autre.

Question 2.
À l'aide du diagramme, expliquez le plasmide pBR322.
Réponse:

pBR-322 est un plasmide naturel et un plasmide F+. Il fait environ 4,3 ko. Il s'agit d'un plasmide avec un site ori (origine de réplication), deux sites de résistance aux antibiotiques, des marqueurs sélectionnables pour la résistance à l'ampicilline (Amp r ) et à la tétracycline (Tet r ). Il compte treize sites uniques dans différentes régions dont sept sont importants. Un site unique est un site de reconnaissance d'enzyme de restriction spécifique (REN) appelé ECORI.

Les vecteurs pour le clonage de gènes chez les plantes et les animaux sont des plasmides Ti isolés d'Agrobacterium tumefaciens chez les plantes et les rétrovirus sont maintenant rendus non pathogènes et sont utilisés pour délivrer des gènes dans des cellules animales.

Remarque : Inactivation insertionnelle : Lorsqu'un gène ou un ADN recombinant est inséré dans la séquence codante d'un vecteur, la séquence codante responsable d'une enzyme ou d'un caractère particulier devient inactivée. C'est ce qu'on appelle l'inactivation insertionnelle.

Question 3.
a) Qu'est-ce que l'électrophorèse sur gel ? Expliquez comment les fragments d'ADN sont séparés et détectés à l'aide de cette technique.
b) Que sont les plasmides ? Mentionnez deux caractéristiques d'un plasmide idéal.
Réponse:
(a) La coupure de l'ADN par des endonucléases de restriction donne des fragments d'ADN. Ces fragments peuvent être séparés par une technique connue sous le nom d'électrophorèse sur gel. Étant donné que les fragments d'ADN sont des molécules chargées négativement, ils peuvent être séparés en les forçant à se déplacer vers l'anode sous un champ électrique à travers un milieu/matrice.

De nos jours, la matrice la plus couramment utilisée est l'agarose qui est un polymère naturel extrait des algues marines. Les fragments d'ADN se séparent (résolvent) en fonction de leur taille grâce à l'effet de tamisage fourni par le gel d'agarose. Par conséquent, plus la taille du fragment est petite, plus il se déplace loin.

Les fragments d'ADN séparés ne peuvent être visualisés qu'après coloration de l'ADN avec un composé connu sous le nom de bromure d'éthidium suivie d'une exposition aux rayons UV (vous ne pouvez pas voir des fragments d'ADN purs à la lumière visible et sans coloration). Vous pouvez voir des bandes d'ADN de couleur orange vif dans un gel coloré au bromure d'éthidium exposé à la lumière UV.

Les bandes d'ADN séparées sont découpées du gel d'agarose et extraites du morceau de gel. Cette étape est connue sous le nom d'élution. Les fragments d'ADN ainsi purifiés sont utilisés dans la construction d'ADN recombinant en les joignant à des vecteurs de clonage.

(b) Les petites molécules d'ADN double brin circulaires et extrachromosomiques présentes dans le cytoplasme des bactéries sont appelées plasmides. Ils montrent une auto-réplication. Ils contiennent 2 à. 8 milliers de paires de bases d'azote. Ils contiennent également des gènes, comme des gènes résistants aux antibiotiques et des gènes pour l'expression de certains caractères. Ils peuvent être coupés à des sites spécifiques en utilisant des enzymes de restriction et les gènes souhaités peuvent être insérés dans ces plasmides.


Biotechnologie : Principes et processus | Notes d'étude | Classe 12 Biologie

Biotechnologie – Domaine de la biologie qui traite de l'utilisation d'organismes vivants ou de systèmes biologiques pour fabriquer des produits ou des processus utiles aux êtres humains.

✔ Biotechnologie selon Fédération européenne de biotechnologie (EFB) – L'intégration des sciences naturelles et des organismes, des cellules, de leurs parties et des analogues moléculaires pour les produits et services.

Principes de biotechnologie

Ingénierie génétique:

o Techniques pour modifier le matériel génétique.

o Il permet l'introduction de ce matériel génétique modifié dans les organismes hôtes.

o Peut changer le phénotype de l'organisme.

Génie des bioprocédés :

o Maintien de la stérilité pour permettre la croissance des seuls microbes souhaités.

▪ Stérile : sans contamination microbienne.

o Empêche la croissance de microbes indésirables.

Quelques concepts de base

o Que se passe-t-il lorsqu'une molécule d'ADN est introduite d'une manière ou d'une autre dans une cellule hôte ?

▪ L'ADN ne peut pas se répliquer dans la cellule hôte.

▪ Très probablement, il sera dégradé.

o Comment faire en sorte que l'ADN étranger se multiplie ou se copie dans la cellule hôte ?

« L'ADN étranger doit faire partie du génome de l'organisme hôte en s'y intégrant.

● Génome : Tout le matériel génétique d'un organisme.

▪ L'ADN étranger se multiplie maintenant avec le chromosome hôte car le chromosome hôte contient le origine de réplication.

● L'origine de réplication est essentielle pour initier le processus de réplication de l'ADN.

▪ Ce processus est appelé clonage ou faire plusieurs copies identiques de n'importe quel ADN matrice.

Construction et clonage de la première molécule d'ADNr artificiel :

o Scientifiques : Stanley Cohen et Herbert Boyer (1972)

o Plasmide natif de Salmonelle typhimurium était lié à un gène de résistance aux antibiotiques.

Plasmide : ADN circulaire extra-chromosomique double brin, à réplication autonome, qui fournit des caractéristiques supplémentaires à la cellule bactérienne si elle est présente.

Gène de résistance aux antibiotiques : Gène qui permet à la bactérie de survivre dans un milieu contenant des antibiotiques.

▪ Identification et coupure d'un morceau d'ADN d'un plasmide qui confère une résistance aux antibiotiques.

● L'ADN a été coupé à un endroit précis.

● Enzyme impliquée : Les enzymes de restriction – Ciseaux moléculaires.

▪ Le morceau d'ADN coupé était lié au plasmide natif de S. typhimurium.

● Enzyme impliquée : ADN ligase

▪ Cet ADN circulaire modifié est un ADN recombiné (ADNr) et agit comme un vecteur.

● Vecteur – porteur d'ADN/gène d'intérêt étranger.

● ADNr – Molécule d'ADN qui a été modifiée et qui peut avoir un segment d'ADN étranger.

▪ Lors de l'introduction de cet ADNr dans Escherichia coli bactéries, l'ADNr a pu se répliquer dans le nouvel hôte (E. coli) et multiplier en nombre en utilisant la nouvelle enzyme ADN polymérase de l'hôte.

▪ Comme le gène original de résistance aux antibiotiques a été multiplié dans le E. coli hôte, ce processus est appelé le clonage du gène de résistance aux antibiotiques dans E. coli.

Trois étapes de base pour modifier génétiquement un organisme

I. Identification de l'ADN avec les gènes désirables

II. Introduction de l'ADN identifié dans l'hôte

III. Maintien de l'ADN introduit dans l'hôte et transfert de l'ADN à sa descendance.

OUTILS DE LA TECHNOLOGIE DE L'ADN RECOMBINANT

Les enzymes de restriction

o 1963 : Découverte de deux enzymes qui pourraient restreindre la croissance du bactériophage chez E. coli.

▪ Une enzyme a ajouté un groupe méthyle à l'ADN.

▪ L'autre enzyme pourrait couper l'ADN- endonucléase de restriction.

o La première endonucléase de restriction identifiée est Hind II.

o Les enzymes de restriction relèvent Nucléases (plus grande classe d'enzymes).

o Supprime les nucléotides de la périphérie/des extrémités de l'ADN.

o Il coupe l'ADN à des positions spécifiques loin de la périphérie de l'ADN.

o L'endonucléase de restriction coupe l'ADN à une position spécifique en reconnaissant une séquence spécifique d'ADN appelée séquence de reconnaissance.

▪ Chaque endonucléase de restriction reconnaît un séquences nucléotidiques palindromiques dans l'ADN.

palindrome dans l'ADN est une séquence de paires de bases qui lit pareil sur les deux brins quand l'orientation de la lecture reste la même.

● Par exemple, les séquences suivantes se lisent de la même manière sur les deux brins dans la direction 5' → 3'. Ceci est également vrai si lu dans le sens 3' → 5'.

o Lors de l'identification de la séquence de reconnaissance, le RE se lie à l'ADN et coupe chacun des deux brins de la double hélice d'ADN à des points spécifiques de leur squelette sucre-phosphate.

Extrémité émoussée et extrémité collante

o De nombreux RE font une simple coupure double brin au milieu de la séquence de reconnaissance, ce qui entraîne une bout émoussé.

▪ Exemples d'ER produisant une extrémité émoussée : PvuII et AluI.

o Dans d'autres RE, les deux brins d'ADN ne sont pas coupés exactement à la même position. Au lieu de cela, la coupe est décalée, généralement de deux ou quatre nucléotides, de sorte que les fragments d'ADN résultants aient de courts surplombs monobrins à chaque extrémité.

▪ Ceux-ci sont appelés extrémités collantes, car l'appariement des bases entre eux peut recoller la molécule d'ADN.

▪ Cette viscosité des extrémités facilite l'action de l'enzyme ADN ligase.




Nomenclature des enzymes de restriction

o Règles de nomenclature des RE :

▪ La première lettre du nom vient du nom de genre.

▪ Les deux deuxièmes lettres proviennent de l'espèce de la cellule procaryote à partir de laquelle elles ont été isolées

▪ Après les trois lettres, la souche est parfois représentée.

Après la souche, les chiffres romains qui suivent les noms indiquent l'ordre dans lequel les enzymes ont été isolées de cette souche de bactéries.

o Exemples : (nécessité de se souvenir de la nomenclature EcoRI uniquement)

Nom de genre de l'organisme source

Nom de l'espèce de l'organisme source

Ordre d'isolement de la souche bactérienne

Étapes de la formation d'ADN recombinant par action de l'enzyme endonucléase de restriction – EcoRI

ADN recombinant (ADNr)

o Les RE sont utilisées en génie génétique pour former des molécules d'ADN « recombinantes » qui sont composées d'ADN provenant de différentes sources/génomes.

o Lorsqu'ils sont coupés par la même enzyme de restriction, les fragments d'ADN résultants ont le même type d'extrémités collantes et peuvent être joints ensemble (de bout en bout) à l'aide d'ADN ligases.

o À moins que l'on ne coupe le vecteur et l'ADN source avec la même enzyme de restriction, la molécule de vecteur recombinant ne peut pas être créée.

Électrophorèse sur gel d'agarose

o Utilisé pour la séparation et l'isolement de fragments d'ADN formés après une digestion de restriction.

o L'électrophorèse sur gel sépare les molécules d'ADN en fonction de leur taille.

o Les molécules d'ADN sont chargées négativement.

▪ en raison de la présence d'une fraction phosphate.

o Les molécules d'ADN peuvent être séparées en les forçant à se déplacer vers l'anode sous l'influence d'un champ électrique à travers un milieu/matrice.

o Matrice utilisée : Agarose

▪ L'agarose est extrait de algues.

o Les fragments d'ADN se séparent (résolvent) selon leur taille grâce à l'effet de tamisage fourni par le gel d'agarose.

▪ Fragments d'ADN plus petits : se déplace le plus loin.

▪ Fragments d'ADN plus gros : se déplacent le moins et sont généralement plus proches des puits de chargement du gel d'agarose.

Visualisation de fragments d'ADN séparés

o L'ADN n'est pas visible sous une lumière normale sans coloration avec un composé qui rend l'ADN visible.

o Bromure d'éthidium (EtBr) est utilisé pour colorer l'ADN dans le gel d'agarose.

o Les différentes bandes d'ADN dans le gel sont clairement visibles sous lumière ultraviolette après coloration avec EtBr.

▪ Cette procédure est très dangereuse car le bromure d'éthidium est un puissant mutagène.

o Les bandes d'ADN apparaissent comme Orange vif bandes colorées.




o Le processus de découpe des bandes d'ADN séparées requises du gel d'agarose et d'extraction de l'ADN du morceau de gel après l'électrophorèse sur gel est appelé élution.

o Ces fragments d'ADN purifiés sont ensuite utilisés dans la construction d'ADN recombinant en les joignant à des vecteurs de clonage.

o Les plasmides et les bactériophages ont la capacité de se répliquer dans les cellules bactériennes indépendamment du contrôle de l'ADN chromosomique.

Copier le numéro dans le vecteur

o Le nombre de copies fait référence au nombre de molécules d'un plasmide/phage individuel qui se trouvent normalement dans une seule cellule bactérienne.

o Certains plasmides peuvent n'avoir qu'une ou deux copies par cellule alors que d'autres peuvent avoir 15 à 100 copies par cellule.

o Les bactériophages en raison de leur nombre élevé par cellule, ont un nombre très élevé de copies de leur génome au sein des cellules bactériennes.

o Si l'ADN étranger (ADN étranger) peut être lié à cet ADN plasmidique ou bactériophage, le nombre d'ADN étranger devient égal au nombre de copies du plasmide ou bactériophage.

o En d'autres termes, plus le nombre de copies est élevé, plus l'expression du gène sera importante, et donc plus le produit obtenu sera obtenu.

Caractéristiques d'un vecteur de clonage

o Certaines caractéristiques sont essentielles au plasmide pour que le clonage ait lieu. Ce sont les suivants :

1. Origine de réplication (ori)

o Séquence où la réplication démarre.

o Si une séquence d'ADN est liée au ‘ori’, il est répliqué.

o ‘Ori’ régule également le nombre de copies de cet ADN lié.

2. Marqueur sélectionnable

o Il aide à identifier les transformants des non-transformants qui peuvent être éliminés.

o Il aide à cultiver sélectivement le transformants.

▪ Transformation – Processus par lequel un ADN étranger (plasmide/vecteur/ADNr) est introduit dans une cellule bactérienne hôte.

▪ Transformants – Cellules bactériennes ayant subi avec succès le processus de transformation et contenant l'ADN étranger.










▪ Gène de résistance aux antibiotiques

● Gène de résistance à l'ampicilline (ampli R)

● Gène de résistance à la tétracycline (tet R)

● Gène de résistance au chloramphénicol

Utilisation d'un marqueur sélectionnable (juste pour votre compréhension !!)

o Il aide à distinguer une cellule qui a absorbé un plasmide (transformant) des milliers de personnes qui n'ont pas absorbé le plasmide (non-transformants).

o Les cellules d'E. coli sont normalement sensibles aux antibiotiques ampicilline et tétracycline.

o Cependant, les cellules qui contiennent le plasmide pBR322 (l'un des premiers vecteurs de clonage à développer) sont résistantes à ces antibiotiques.

o C'est parce que pBR322 porte des gènes qui fabriquent la cellule hôte (E. coli) résistant à l'ampicilline et à la tétracycline lorsqu'ils sont exprimés.

o Après transformation avec pBR322, seules les cellules E. coli ayant repris un plasmide sont amp R tet R et capables de former des colonies sur un milieu gélosé contenant de l'ampicilline ou de la tétracycline.

o Les non-transformants, qui ne contiennent pas le pBR322, ne peuvent pas exprimer les gènes de résistance aux antibiotiques, donc ne produisent pas de colonies sur le milieu gélosé contenant de l'ampicilline ou de la tétracycline.

o Les transformants et les non-transformants se distinguent donc facilement.

3. Sites de clonage




o Il fait référence au segment d'ADN dans le plasmide où l'ADN étranger (étranger) peut être inséré.

o Le vecteur/plasmide devrait idéalement avoir un ou très peu de sites de reconnaissance pour l'ER couramment utilisé.




o Pour le processus de clonage, un RE est choisi qui fait généralement partie du marqueur de sélection.

▪ Par exemple, un ADN étranger peut être ligaturé au BamH je site du gène de résistance à la tétracycline dans le vecteur pBR322.

Inactivation insertionnelle

o Lorsque nous cultivons des cellules bactériennes sur un milieu sélectif (milieu gélose contenant de l'ampicilline ou de la tétracycline), nous pouvons différencier les transformants des non-transformants.

o Mais nous n'avons toujours aucune idée si les transformants contiennent l'ADN plasmidique recombinant ou l'ADN plasmidique d'origine.

o Cette technique est utilisée pour identifier les recombinants des non-recombinants.

▪ Recombinants – ADN plasmidique avec l'ADN étranger/alien/cible inséré.

o L'insertion d'un fragment d'ADN étranger dans le plasmide détruit l'intégrité d'un des gènes (gène marqueur sélectionnable) présent sur la molécule.




o Les recombinants peuvent donc être identifiés car la caractéristique codée par le gène inactivé n'est plus affichée par les cellules hôtes.

Inactivation insertionnelle d'un gène de résistance aux antibiotiques

o Lorsqu'un ADN étranger au BamH je site du gène de résistance à la tétracycline dans le vecteur pBR322 est ligaturé, les plasmides recombinants perdront la résistance à la tétracycline en raison de l'insertion d'ADN étranger.

o Il peut toujours être sélectionné parmi les non-recombinants en étalant les transformants sur un milieu contenant de la tétracycline.

o Les transformants poussant sur un milieu contenant de l'ampicilline sont ensuite transférés sur un milieu contenant de la tétracycline.

o Les recombinants se développeront dans un milieu contenant de l'ampicilline mais pas sur celui contenant de la tétracycline.

o Mais les non-recombinants se développeront sur le milieu contenant les deux antibiotiques.




Inactivation insertionnelle sans gène de résistance aux antibiotiques (gène de la β-galactosidase)

o Ici, les recombinants et les non-recombinants sont différenciés en fonction de leur capacité à produire de la couleur en présence d'un substrat chromogène.

o Dans cette méthode, l'ADN étranger/cible est inséré dans la séquence codante d'une enzyme, -galactosidase.

o Cela a inactivé l'expression du gène de la -galactosidase.




o Lorsque le substrat chromogène (X-gal) est ajouté, les colonies bactériennes avec la -galactosidase fonctionnelle donnent une couleur bleue, tandis que les colonies bactériennes sans la β-galactosidase fonctionnelle ne donnent aucune couleur.










Nomenclature de pBR322 (Informations supplémentaires)

o “p” indique qu'il s'agit bien d'un plasmide.

o “BR” identifie le laboratoire dans lequel le vecteur a été construit à l'origine (BR signifie Bolivar et Rodriguez, les deux chercheurs qui ont développé pBR322).

o �” distingue ce plasmide des autres développés dans le même laboratoire (il existe aussi des plasmides appelés pBR325, pBR327, pBR328, etc.).

Vecteur pour le clonage de gènes chez les plantes et les animaux

Agrobacterium tumifaciens : Il délivre de l'ADN dans plusieurs plantes dicotylédones et transforme les cellules normales en tumeurs et dirige ces cellules tumorales pour produire les produits chimiques requis par l'agent pathogène.

▪ Le plasmide ‘Ti’ de A tumifaciens a été modifié en vecteur de clonage.

● Il n'est plus pathogène pour les plantes.

● Il peut transmettre le gène étranger à un grand nombre de plantes.

Rétrovirus : Il peut transformer les cellules animales normales en cellules cancéreuses.

▪ Il a maintenant été modifié comme suit :

● Il n'est plus pathogène pour les cellules animales.

● Il peut introduire le gène étranger dans des cellules animales.

Introduction d'ADN étranger dans la cellule hôte

Transformation bactérienne

o Processus d'absorption de l'ADN par les bactéries.

Cellules compétentes

o L'ADN étant de nature hydrophile, il ne peut pas traverser les membranes cellulaires.

o Toutes les cellules bactériennes ne peuvent pas prendre l'ADN désiré.

o Seulement cellules bactériennes compétentes peut prendre l'ADN.

▪ Ces cellules sont préparées en les traitant avec une concentration spécifique d'un cation divalent, tel que calcium.[ 50 mM de chlorure de calcium (CaCl2)]

▪ Il augmente l'efficacité avec laquelle l'ADN pénètre dans la bactérie à travers les pores de sa paroi cellulaire.

Processus de transformation (traitement de choc thermique)

o Les cellules compétentes sont incubées avec l'ADNr (ADN étranger/cible) dans un glace froide état.

un choc thermique est donné aux cellules en les plaçant brièvement à 42 0 C.

o Les cellules sont ensuite à nouveau replacées sur la glace.

o Cela permet aux cellules compétentes de capter l'ADN étranger.

Micro-injection

o Ici, l'ADNr est directement injecté dans le noyau de la cellule hôte.

o Il utilise une pipette très fine pour injecter des molécules d'ADN.

o Cette méthode est généralement utilisée pour les cellules animales.

Pistolet biolistique / à gène

o Les cellules hôtes sont bombardées de microprojectiles à grande vitesse, généralement des particules d'or ou de tungstène recouvert d'ADN.

o Cette méthode est plus adaptée aux cellules végétales.




PROCESSUS DE LA TECHNOLOGIE DE L'ADN RECOMBINANT

o La technologie de l'ADN recombinant implique plusieurs étapes dans une séquence spécifique telles que l'isolement de l'ADN, la fragmentation de l'ADN par des endonucléases de restriction, l'isolement d'un fragment d'ADN souhaité, la ligature du fragment d'ADN dans un vecteur, le transfert de l'ADN recombinant dans l'hôte, la culture de l'hôte cellules dans un milieu à grande échelle et extraction du produit souhaité.

Isolement de l'ADN

o L'ADN est isolé en dégradant d'abord toutes les membranes l'entourant avec des enzymes spécifiques

▪ Pour les cellules bactériennes – Lysozyme

▪ Pour les cellules végétales – Cellulase

▪ Pour les cellules fongiques – Chitinase

o L'ARN est éliminé par traitement avec des enzymes de digestion de l'ARN – Ribonucléase.

o Les protéines sont éliminées par traitement avec des enzymes de digestion des protéines – Protéase.

o D'autres biomolécules sont éliminées par des traitements appropriés.

o Enfin, l'ADN est précipité par l'ajout d'éthanol refroidi.

▪ Ceci est considéré comme une collection de fils fins dans la suspension.

▪ Cet ADN peut être retiré par spooling.

Coupe d'ADN à des endroits spécifiques

o L'ADN peut être coupé à un endroit spécifique en digérant l'ADN purifié avec une enzyme de restriction spécifique.

o L'électrophorèse sur gel d'agarose peut être utilisée pour vérifier la progression de la digestion de restriction.

o Après que l'ADN source et l'ADN vecteur aient été coupés avec un RE spécifique, le gène d'intérêt est coupé et est ligaturé avec l'ADN vecteur coupé (plasmide).

▪ La ligature du gène d'intérêt et de l'ADN vecteur est médiée par une enzyme nommée – ADN ligase.

Amplification du gène d'intérêt par PCR

o La réaction en chaîne par polymérase (PCR) entraîne l'amplification sélective d'une région choisie d'une molécule d'ADN.

Exigences pour la PCR

o Enzyme thermostable : Taq Polymérase

▪ Source : Bactérie - Thermus aquatique

▪ Propriété:L'enzyme reste active pendant la haute température.

o Ensembles de Amorces :

Les amorces sont de petits oligonucléotides synthétisés chimiquement qui sont complémentaires des régions de l'ADN.

▪ Ils délimitent la région de l'ADN à amplifier.

Étape impliquée dans la PCR

o La PCR est réalisée dans un seul tube à essai en mélangeant simplement l'ADN avec un ensemble de réactifs et en plaçant le tube dans un thermocycleur.

1. Dénaturation

o Le mélange est chauffé à 94°C, température à laquelle les liaisons hydrogène qui maintiennent ensemble les deux brins de la molécule d'ADN double brin sont rompues, provoquant la dénaturation de la molécule.

o Il forme de l'ADN simple brin (ADNsb).

2. recuit

o Le mélange est refroidi à 50󈞨°C.

o Les amorces s'hybrident (se joignent) avec les molécules d'ADNsb à des positions spécifiques.

3. Extension

o La température est augmentée à 74°C.

o Le Taq L'ADN polymérase fonctionne mieux à cette température.

o Il se fixe à une extrémité de chaque amorce et synthétise de nouveaux brins d'ADN, complémentaires aux molécules d'ADN matrice.

o Il en résulte quatre peuplements d'ADN au lieu des deux qu'il y avait au départ.

Insertion d'ADN recombinant dans la cellule/l'organisme hôte




o Les cellules receveuses, après les avoir rendues « compétentes » pour recevoir, absorbent l'ADN présent dans leur environnement.

o Ainsi, si un gène porteur d'ADN recombinant pour la résistance à un antibiotique (par exemple, l'ampicilline) est transféré dans E. coli. cellules, les cellules hôtes se transforment en cellules résistantes à l'ampicilline.

o Si nous étalons les cellules transformées sur des plaques de gélose contenant de l'ampicilline, seuls les transformants se développeront, les cellules receveuses non transformées mourront.

o Puisque, en raison du gène de résistance à l'ampicilline, on est capable de sélectionner une cellule transformée en présence d'ampicilline. Le gène de résistance à l'ampicilline dans ce cas est appelé marqueur sélectionnable.

Obtention du produit génétique étranger

o Dans la plupart des technologies de recombinaison, le but ultime est de produire une protéine souhaitable.

o Le gène étranger s'exprime et produit le maximum de protéines dans des conditions appropriées.

o Protéine recombinante : Si un gène codant pour une protéine est exprimé dans un hétérologue hôte.

Culture de la cellule hôte

o Les cellules hôtes avec l'ADNr sont cultivées dans des conditions appropriées (nutriments appropriés, température, pH, etc.)

o Culture à petite échelle : Les cellules sont cultivées en laboratoire en cultures. Les protéines sont ensuite extraites et purifiées en utilisant différentes techniques de séparation.

o Culture à grande échelle : les cellules sont cultivées dans système de culture continue dans lequel le milieu utilisé est drainé d'un côté tandis que du milieu frais est ajouté de l'autre pour maintenir les cellules dans leur phase logarithmique/exponentielle physiologiquement la plus active.

o Il s'agit de grands récipients de grands volumes (100-1000 litres), dans lesquels les matières premières sont biologiquement transformées en produits spécifiques, enzymes individuelles, etc., à l'aide de cellules microbiennes, végétales, animales ou humaines.

o Il fournit les conditions optimales pour obtenir le produit souhaité en offrant des conditions de croissance optimales (température, pH, substrat, sels, vitamines, oxygène).

Composants d'un bioréacteur :




▪ un système de distribution d'oxygène

▪ un système de contrôle de la température

▪ ports d'échantillonnage afin que de petits volumes de la culture puissent être retirés périodiquement

Bioréacteur à réservoir agité

o Un réacteur à cuve agitée est généralement cylindrique ou avec une base incurvée pour faciliter le mélange du contenu du réacteur.

o L'agitateur facilite le mélange et la disponibilité de l'oxygène dans tout le bioréacteur.

Bioréacteur à réservoir agité barboté

o C'est un bioréacteur de type réacteur à cuve agitée où l'air est barboté.

Execution en aval

o Elle concerne toutes les étapes postérieures à l'expression du produit génique dans le système de culture par les cellules hôtes (étape de biosynthèse).

o Les processus comprennent séparation et purification, qui sont collectivement appelés traitement en aval.

o Convient conservateurs si nécessaire sont ajoutés.

o Si le produit est un médicament, alors il subit essais cliniques.

o Le traitement en aval et les tests de contrôle qualité varient d'un produit à l'autre.

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L'inactivation par insertion du gène Streptococcus mutans dexA (dextrane) entraîne une altération de l'adhérence et du catabolisme du dextrane

Streptococcus mutans est capable de synthétiser des glucanes extracellulaires à partir de saccharose qui contribuent à l'adhérence de ces bactéries. La dextranase extracellulaire peut dégrader partiellement les glucanes et peut donc affecter la virulence de S. mutans. Afin d'isoler les mutants incapables de produire de la dextranase, une banque d'ADN a été construite en insérant des fragments aléatoires digérés par Sau3AI d'ADN chromosomique de S. mutans dans le site BamHI du vecteur d'intégration streptococcique pVA891, qui est capable de se répliquer dans Escherichia coli mais ne ne possèdent pas d'origine de réplication streptococcique. Les plasmides résultants ont été introduits dans S. mutans LT11, permettant l'inactivation par insertion par recombinaison homologue. Deux transformants ont été identifiés qui ne possédaient pas d'activité de dextrane. L'intégration d'une seule copie du plasmide dans le chromosome de ces transformants a été confirmée par analyse d'hybridation Southern. Des fragments d'ADN chromosomique flanquant le plasmide ont été récupérés à l'aide d'une technique de récupération de marqueur et séquencés. La comparaison avec des séquences connues utilisant le programme BLASTX a montré une homologie de 56 % au niveau des acides aminés entre le fragment de gène séquencé et la dextranase de Streptococcus sobrinus, suggérant fortement que le gène de la dextranase de S. mutans (dexA) avait été inactivé. La morphologie de la colonie des mutants de dextrane lorsqu'ils ont été cultivés sur de la gélose Todd-Hewitt contenant du saccharose a été altérée par rapport à la souche parentale, avec une accumulation apparente de polymère extracellulaire. Les mutants étaient également plus adhérents à une surface lisse que LT11, mais il n'y avait aucune différence apparente dans l'agrégation cellule-cellule dépendante du saccharose. (RÉSUMÉ TRONQUÉ À 250 MOTS)


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Résumé

Méthionine (rencontré) S-methyltransferase (MMT) catalyzes the synthesis of S-methyl-Met (SMM) from Met andS-adenosyl-Met (Ado-Met). SMM can be reconverted to Met by donating a methyl group to homocysteine (homo-Cys), and concurrent operation of this reaction and that mediated by MMT sets up the SMM cycle. SMM has been hypothesized to be essential as a methyl donor or as a transport form of sulfur, and the SMM cycle has been hypothesized to guard against depletion of the free Met pool by excess Ado-Met synthesis or to regulate Ado-Met level and hence the Ado-Met toS-adenosylhomo-Cys ratio (the methylation ratio). To test these hypotheses, we isolated insertional mmtmutants of Arabidopsis and maize (Zea mays). Both mutants lacked the capacity to produce SMM and thus had no SMM cycle. They nevertheless grew and reproduced normally, and the seeds of the Arabidopsis mutant had normal sulfur contents. These findings rule out an indispensable role for SMM as a methyl donor or in sulfur transport. The Arabidopsis mutant had significantly higher Ado-Met and lowerS-adenosylhomo-Cys levels than the wild type and consequently had a higher methylation ratio (13.8 versus 9.5). Free Met and thiol pools were unaltered in this mutant, although there were moderate decreases (of 30%–60%) in free serine, threonine, proline, and other amino acids. These data indicate that the SMM cycle contributes to regulation of Ado-Met levels rather than preventing depletion of free Met.

The SMM cycle and its relationship to the activated methyl cycle. The reactions catalyzed by MMT and HMT are bolded. CH3-THF, 5-Methyltetrahydrofolate THF, tetrahydrofolate.

The SMM cycle and its relationship to the activated methyl cycle. The reactions catalyzed by MMT and HMT are bolded. CH3-THF, 5-Methyltetrahydrofolate THF, tetrahydrofolate.

The functions of SMM and its seemingly wasteful cycle are for the most part unknown. The only established role of SMM is in transporting reduced sulfur in the phloem, for which there is qualitative evidence in a range of plants including Arabidopsis ( Bourgis et al., 1999). The importance of SMM relative to other translocated forms of sulfur has been quantified only in wheat (Triticum aestivum), where it accounts for one-half the sulfur moving to developing grains ( Bourgis et al., 1999). However, the contribution of SMM to sulfur transport may be less in other species ( Bourgis et al., 1999) and may depend on developmental stage and sulfur nutrition ( Fitzgerald et al., 2001). A hypothetical role for SMM is as methyl donor for a plant-specific reaction ( Giovanelli et al., 1980). This role has not been tested but is attractive because it would obviously explain why plants alone have SMM.

Roles in transport or methylation might explain why plants produce SMM, but not why there is futile cycling of SMM throughout the plant. Two hypotheses have been advanced to justify this cycling. The first is that the SMM cycle prevents overshoots in Ado-Met synthesis from depleting the free Met pool required for protein synthesis ( Mudd and Datko, 1990) by providing a way to convert Met moieties locked up in Ado-Met back to free Met. The second hypothesis is that the SMM cycle is a means whereby plants control Ado-Met level in the absence of the feedback loops between Ado-Met and the enzymes involved in its synthesis that occur in other eukaryotes ( Ranocha et al., 2001 Roje et al., 2002). Controlling the levels of Ado-Met and AdoHcy is considered crucial to the many methyl transfer reactions that take place in cells: AdoHcy is a potent competitive inhibitor of methyltransferases ( Cantoni et al., 1979) so that the Ado-Met:AdoHcy ratio (the methylation ratio) determines the activity of these enzymes ( Cantoni, 1977). Computer modeling of the SMM cycle in Arabidopsis leaves, based on data for wild-type plants, favored the hypothesis that the SMM cycle contributes to the control of Ado-Met level. Thus, when the SMM cycle was eliminated in silico, the Ado-Met level increased by up to 160%, but steady-state free Met levels did not change. Moreover, the free Met pool recovered from a simulated overshoot in Ado-Met synthesis almost as fast in the absence of the SMM cycle as in its presence ( Ranocha et al., 2001).

In the present study, we investigated the function of SMM and its cycle by isolating and characterizing insertional knockout mutants of MMT in Arabidopsis and maize (Zea mays), which both have singleMMT genes ( Bourgis et al., 1999). We found that SMM is dispensable but that eliminating it caused an increase in Ado-Met level and in the methylation ratio.


Analysis and nucleotide sequence of an origin of DNA replication in Acinetobacter calcoaceticus and its use for Escherichia coli shuttle plasmids

A shuttle plasmid for Acinetobacter calcoaceticus and Escherichia coli has been constructed from a cryptic A. calcoaceticus lwoffi plasmid and pBR322. It is transformed to A. calcoaceticus BD413 by natural competency, yielding about 10(6) transformants per microgram of plasmid DNA. The ApR and TcR genes of pBR322 are functional in A. calcoaceticus. A gene bank was constructed from chromosomal A. calcoaceticus DNA and the shuttle plasmid. Direct transformation to A. calcoaceticus yielded about 95% recombinants, indicating a sixfold enrichment of recombinant plasmids compared to E. coli. One clone complementing a trpE mutation carried a 20-kb insertion and transformed with a 30-fold higher efficiency when compared to the vector. A deletion analysis of the shuttle plasmid indicates that 2.2 kb is necessary for autonomous replication and stable maintenance in A. calcoaceticus. No rearrangements of the DNA or loss of plasmids are found in that organism, even in the absence of selective pressure, when this sequence is present. A further insertional inactivation analysis creating lacZ transcriptional fusions suggests that the origin of replication (ori) is contained within about 1350 bp. Analysis of beta-galactosidase production in A. calcoaceticus indicates that only a weak promoter activity is directed out of one end of this ori. Its sequence contains A + T-rich regions, an 18-bp element with nearly perfect palindromic symmetry and eleven repeats of the consensus sequence, AAAAAATAT, eight of which are clustered within 360 bp. However, no open reading frames or significant homologies to other ori were found.


DNA cloning in Bacillus subtilis. III. Efficiency of random-segment cloning and insertional inactivation vectors ☆

Random segments of Bacillus amyloliquefaciens and yeast Saccharomyces cerevisiae DNA were used to determine two parameters pertinent to cloning in Bacillus subtilis, the yield of hybrids and the mean size of cloned segments. 10 3 to 10 4 hybrids/μg of DNA segments were obtained. Hybrids represented 11–18% of transformants. Mean m. poids of cloned DNA segments was about 1 × 10 6 , substantially lower than 3 × 10 6 found for donor DNAs after digestion with restriction endonucleases.

We have cloned a B. amyloliquefaciens DNA segment which complemented a deficiency in B. subtilis hisH et E. coli hisC genes, which encode imidazolylacetolphosphate aminotransferase. The cloning efficiency for this gene was 10 transformed hosts/μg of donor DNA.

Nombreuses B. subtilis insertional-inactivation cloning vectors were examined. One, pHV41, allows inactivation of the kanamycin-resistance (Km R ) gene by insertion into its unique BglII site. In two other vectors, pHV11 and pHV23, insertion in their unique Kpn site inactivates the tetracycline-resistance (Tc R ) gene. pHV23 replicates both in E. coli et B. subtilis, and carries unique sites for seven restriction endonucleases (BamHI, ÉcoRI, HpaJE, KpnJE, PstJE, SalJE, XbaI). This makes it one of the most versatile B. subtilis cloning vectors yet described.


Voir la vidéo: cloning vectorcompetent hostpBR322. biotechnology principle and process in hindi (Mai 2022).