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Pourquoi de nombreuses solutions d'ADN contiennent-elles des composés supplémentaires ?

Pourquoi de nombreuses solutions d'ADN contiennent-elles des composés supplémentaires ?


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Les données sur la solubilité de l'ADN dans l'eau seulement sont rares.

Une question précédente demandait une quantification de la solubilité de l'ADN dans l'eau. Il semblait qu'il serait facile de répondre, mais ce n'est pas si simple car aucune donnée ne semble exister pour la solubilité de l'ADN dans exclusivement de l'eau.

Même la petite quantité de données sur l'eau était dans le contexte de l'élimination des composés organiques de la solution. Cela m'a fait réfléchir. L'ADN se trouve dans une solution aqueuse dans des situations biologiques et est généralement manipulé dans des solutions aqueuses dans les laboratoires. Alors pourquoi les données de solubilité sont-elles si rares pour pur l'eau? Qu'est-ce qui est important à propos des composés organiques pour les solutions d'ADN ?

Pourquoi d'autres additifs sont-ils importants pour les solutions d'ADN de laboratoire ?

Alors ma question est Pourquoi l'ADN est-il dissous dans exclusivement de l'eau apparemment « rare » dans les laboratoires ? Y a-t-il quelque chose dans l'eau pure qui est mauvais pour le stockage de l'ADN ? Est-ce que fonctionnellement l'ADN n'a jamais besoin d'être dans l'eau car il est inaccessible aux protéines ? Ou ai-je mal interprété le manque de données de solubilité ; l'eau est monnaie courante et aucune donnée n'existe parce qu'il n'y en a pas besoin ?

J'imagine que la PCR est l'endroit où la plupart des données sur les solutions d'ADN existent. Qu'en est-il des solvants/composés organiques polaires qui les rendent importants pour les solutions d'ADN ?


ADN dans de l'eau pure.

Le seul moment où les acides nucléiques rencontreraient de l'eau pure serait dans un laboratoire - par exemple, après qu'un oligonucléotide est synthétisé in vitro, les groupes protecteurs sont retirés des atomes réactifs dans la séquence finie et le produit final est clivé du support. matrice. À ce stade, vous pouvez lyophiliser (lyophiliser) la solution d'hydroxyde d'ammonium et remettre en suspension l'oligo simple brin dans de l'eau pure.

Des composés supplémentaires améliorent la solubilité des oligomères lourds.

Cependant, comme indiqué dans les commentaires, la solubilité des acides nucléiques, en particulier l'ADN de poids moléculaire élevé, comme l'ADN génomique, est améliorée dans les solutions contenant des cations monovalents dilués. 10 mM de TrisHCl, pH 8,0, 1 mM d'EDTA suffisent pour presque toutes les applications. L'EDTA inhibe toutes les DNAses errantes et inhibe également légèrement la croissance microbienne.

Les composés agissent comme des tampons de pH.

Tris n'est pas le meilleur tampon biologique mais a une solubilité élevée et est relativement bon marché et stable. Si la solution devient trop basique, les brins d'ADN fondront et si la solution devient trop acide, les purines commenceront à se désaminer.

L'ADN n'expérimente jamais d'eau pure en biologie.

À partir du moment où l'ADN est synthétisé dans une cellule jusqu'à ce que cette cellule meure et que son ADN soit finalement dégradé, elle ne rencontre pas un environnement d'eau pure.


Alors que les expériences physiologiques pourraient être menées sans solvants organiques, les synthèses chimiques d'ADN ou d'analogues, la modification chimique de l'ADN et la purification après réaction chimique pourraient être effectuées en présence de solvants organiques. De telles expériences ne concernent pas directement la physiologie, mais nous utilisons de l'ADN et des analogues d'ADN synthétisés chimiquement. De plus, les propriétés chimiques de l'ADN en présence de solvants organiques peuvent indiquer comment l'ADN se comporte dans des conditions physiologiques. Les personnes faisant de la PCR et/ou de la biologie moléculaire peuvent ne pas être intéressées par la solubilité de l'ADN, car dans les conditions qu'elles utilisent, les concentrations sont bien inférieures à la condition saturée.


Pourquoi de nombreuses solutions d'ADN contiennent-elles des composés supplémentaires ? - La biologie

Depuis la découverte des acides nucléiques par Fredrick Miescher en 1870, ils ont longtemps été considérés comme une curiosité jusqu'à ce que les structures des unités monomères, les nucléotides, soient établies en 1909 et que celle de l'ARN soit proposée par Levene et Tipson en 1935. Les acides nucléiques sont fondamentalement de deux types : l'ADN et l'ARN, qui sont des polymères de chaînes nucléotidiques. Chaque nucléotide comprend trois parties, tout d'abord - une partie sucre qui est un pentose (cycle à cinq chaînons) joint à une seconde partie des groupes phosphate. Le carbone anomérique de chaque sucre est lié à l'atome d'azote d'une troisième partie - composé hétérocyclique dans une liaison ß-glycosidique. La liaison est nommée ainsi, car les substituants en C-1 et C-4 sont du même côté du cycle furanose.

Comme les composés hétérocycliques qui faisaient partie des acides nucléiques contenaient des groupes amine et qu'en général les amines agissent comme des bases, ces composés hétérocycliques ont également été arbitrairement appelés bases. De plus, étant donné que l'hétéroatome du cycle est l'azote, ces composés ont été nommés bases azotées. Les bases azotées sont des molécules planes, aromatiques, hétérocycliques qui sont pour la plupart des dérivés de purine ou de pyrimidine. Il n'y a que quatre bases dans l'ADN : deux sont des purines substituées (adénine et guanine) et deux sont des pyrimidines substituées (cytosine et thymine). L'ARN ne contient également que quatre bases. Trois (adénine, guanine et cytosine) sont les mêmes que ceux de l'ADN, mais la quatrième base de l'ARN est l'uracile au lieu de la thymine. La thymine et l'uracile ne diffèrent que par un groupe méthyle - la thymine est le 5-méthyluracile.

Pourquoi les acides nucléiques ne contiennent-ils que des sucres ribose ou désoxy-ribose ?
Dans l'ARN, le sucre du cycle à cinq chaînons est le D-ribose. Dans l'ADN, il s'agit du 2'-désoxy-D-ribose (D-ribose sans groupe OH en position 2). Le choix du cycle à cinq chaînons est par défaut car ces cycles sont les plus stables parmi les composés aromatiques, sauf dans le cas du benzène, un cycle à six chaînons qui est stabilisé par résonance. Parmi les pentoses, le Ribose est sélectionné au cours de l'évolution, en tant que composant sucre exclusif des acides nucléiques. La sélection est expliquée en utilisant des modèles moléculaires et en éliminant la plupart des autres sucres courants en examinant leur structure chimique et en envisageant comment ils s'intégreraient dans un modèle d'acide nucléique. Les comparaisons des conformations des plis de sucre et des configurations des pentoses indiquent que le ribose n'a pas été sélectionné au hasard mais le seul choix, puisque le ß-D-ribose s'intègre le mieux dans la structure des formes physiologiques des acides nucléiques. Dans d'autres nucléotides contenant de l'arabinose, du xylose ou du lyxose, le C2'-OH et/ou le C3'-OH sont au-dessus du cycle furanose, provoquant une interférence stérique avec la base volumineuse et le groupe C5'-OH.

Pourquoi les acides nucléiques sont chargés négativement ?
L'acide phosphorique lie les sucres dans l'ARN et l'ADN. L'acide a trois groupes OH dissociables avec des valeurs de pKa de 1,9, 6,7 et 12,4. Chacun des groupes -OH de l'acide phosphorique est également capable de réagir avec un alcool (acide + alcool -> ester) pour donner un phosphomonoester, un phosphodiester ou un phosphotriester. Dans les acides nucléiques, le groupe phosphate ne forme qu'un phosphodiester. Bien que l'acide phosphorique soit capable de former trois liaisons ester, il ne forme que deux liaisons, laissant le troisième groupe -OH libre, qui, lors de la dissociation, confère une charge négative. Dans le cas de l'ARN, le groupe 2'-OH supplémentaire ajoute également à la charge négative. Par conséquent, l'ARN a plus de charge et est donc moins stable et présente une plus grande mobilité lors de l'électrophorèse que l'ADN.


Le chauffage des molécules d'acide phosphorique entraîne la formation d'acide pyrophosphorique, qui est un phosphoanhydride. formé par la perte d'une molécule d'eau. Le nom pyrophosphate est dérivé du mot grec - pyr, qui signifie "feu". Ainsi, l'acide pyrophosphorique est préparé par « feu », c'est-à-dire par chauffage. De la manière précitée, de l'acide triphosphorique et des acides polyphosphoriques supérieurs peuvent également être formés, en raison de la capacité de l'acide phosphorique à former un anhydride.

Les nucléotides peuvent exister sous forme de monophosphates, diphosphates et triphosphates et sont nommés en ajoutant monophosphate ou diphosphate ou triphosphate au nom du nucléoside. Ces liaisons phosphoanhydride sont des liaisons à haute énergie, ce qui signifie que lorsque ces liaisons sont rompues, elles libèrent beaucoup d'énergie, qui peut être utilisée simultanément pour entraîner d'autres réactions chimiques dans la cellule.

Les purines et les pyrimidines sont liées au carbone anomérique du cycle furanose - purines en N-9 et pyrimidines en N-1 - dans une liaison -glycosidique. Un composé contenant une base liée au D-ribose ou au 2'-désoxy-D-ribose est appelé un nucléoside. Dans un nucléoside, les positions cycliques du sucre sont indiquées par des nombres premiers pour les distinguer des positions cycliques de la base. C'est pourquoi le composant sucre de l'ADN est appelé 2'-désoxy-D-ribose. Par exemple, l'adénine est la base, tandis que l'adénosine est le nucléoside. De même, la cytosine est la base, tandis que la cytidine est le nucléoside, et ainsi de suite. L'uracile ne se trouve que dans l'ARN et est donc attaché au D-ribose mais pas au 2-désoxy-D-ribose. De même, comme la thymine ne se trouve que dans l'ADN, elle est attachée au 2-désoxy-D-ribose mais pas au D-ribose.

Un nucléotide est un nucléoside avec le groupe 5' ou 3' -OH lié par une liaison ester à l'acide phosphorique. Les nucléotides de l'ARN - où le sucre est le D-ribose - sont plus précisément appelés ribonucléotides, tandis que les nucléotides de l'ADN - où le sucre est le 2-désoxy-D-ribose - sont appelés désoxyribonucléotides.

Fonctions biologiques des nucléotides :
Les nucléotides, en plus d'agir en tant qu'unités intégrales d'ADN et d'ARN, effectuent diverses activités cellulaires telles que des donneurs d'énergie chimique, des messagers secondaires dans la signalisation cellulaire, des cofacteurs pour les enzymes, des vasidialteurs, des porteurs de sous-unités nécessaires à la synthèse de la paroi cellulaire et à la biosynthèse des lipides.

ATP- Devise de la cellule :
Tous les systèmes vivants ont besoin d'énergie pour assurer leur survie et leur reproduction et ils en tirent de l'énergie en convertissant les nutriments en une forme d'énergie chimiquement utile. La forme la plus importante d'énergie chimique est l'adénosine-triphosphate (ATP). L'importance de l'ATP dans les réactions biologiques est démontrée par son taux de renouvellement chez l'homme : chaque jour, une personne utilise une quantité d'ATP équivalente à son poids corporel. L'ATP est connu comme le vecteur universel d'énergie chimique car il est couramment utilisé dans tous les systèmes vivants, des procaryotes aux eucaryotes. L'ATP a la capacité de convertir les réactions thermodynamiquement défavorables en réactions favorables, car "l'énergie d'hydrolyse de l'ATP convertit les réactions endergoniques en réactions exergoniques".

Le secret de la stabilité de l'ATP :
Comme on peut le remarquer à partir de la structure de l'ATP, il est fortement chargé négativement car tout nucléotide triphosphate a quatre unités de charge négative et doit être très réactif et le rendre ainsi moins stable. Compte tenu du fait ci-dessus, bien que l'ATP réagisse facilement dans les réactions catalysées par une enzyme, mais de manière surprenante, sa vitesse de réaction est assez lente en l'absence d'une enzyme. Comparé aux anhydrides d'acide carboxylique qui s'hydrolysent en quelques minutes, l'ATP met plusieurs semaines à s'hydrolyser. Le faible taux d'hydrolyse de l'ATP est une conséquence favorable pour la cellule car il peut être retenu dans la cellule pendant une période de temps plus longue et être disponible en cas de besoin pour une réaction catalysée par une enzyme. Il est très intéressant de savoir que la raison de la lente réactivité de l'ATP en l'absence d'enzymes est sa charge négative qui repousse l'approche des nucléophiles. Lorsque l'ATP est lié à un site actif d'une enzyme, il se complexe avec le magnésium, ce qui diminue la charge négative globale de l'ATP. C'est pourquoi les enzymes nécessitant de l'ATP nécessitent également des ions métalliques. Les deux autres charges négatives peuvent être stabilisées par des groupes chargés positivement tels que des résidus d'arginine ou de lysine au niveau du site actif. Sous cette forme, l'ATP est facilement approché par les nucléophiles, de sorte que l'ATP réagit rapidement dans une réaction catalysée par une enzyme, mais seulement très lentement en l'absence de l'enzyme.

  • L'ATP n'est pas le seul nucléotide biologiquement important. Le guanosine-triphosphate (GTP) est également utilisé à la place de l'ATP dans certaines réactions de transfert de phosphoryle. Le GTP entraîne la formation de liaisons peptidiques pendant la traduction. GTP et GDP sont également impliqués dans la signalisation médiée par les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG).
  • L'UDP sert de porteur de la fraction glucose sous la forme d'UDP-glucose, nécessaire à la synthèse de la paroi cellulaire chez les bactéries.
  • La CDP-Choline agit en tant que transporteur du groupe Choline pour la synthèse du phospholipide membranaire-Phosphotidyl Choline.
  • Les dinucléotides tels que FAD, FMN sont utilisés comme agents oxydants et NADH, NADPH sont utilisés comme agents réducteurs.
  • Un autre nucléotide important est l'adénosine-monophosphate, communément appelé AMP cyclique. L'AMP cyclique est appelé « second messager » car il sert de lien entre plusieurs hormones (les premiers messagers) et certaines enzymes qui régulent la fonction cellulaire. La sécrétion de certaines hormones, comme l'adrénaline, active l'adénylate cyclase, l'enzyme responsable de la synthèse de l'AMP cyclique à partir de l'ATP. L'AMP cyclique active alors une enzyme, généralement en la phosphorylant.
  • L'adénosine agit comme inducteur de sommeil et est disponible dans le commerce sous le nom d'« adénocarpe »

L'agent réducteur est le NADPH et chaque NADPH produit dans la cellule peut générer trois ATP. Sur la base de ce fait, l'utilisation de NADPH pour réduire le dihydrofolate se fait au détriment de l'ATP. Bien que le processus de synthèse de la thymine soit énergétiquement coûteux, la cellule préfère néanmoins recruter la thymine dans l'ADN plutôt que l'uracile.
La présence d'uracile dans l'ADN est mutagène et la présence de thymine prévient les mutations potentiellement mortelles. Le phénomène chimique derrière cela est l'instabilité chimique de la cytosine qui peut tautomériser pour former une imine, qui est ensuite hydrolysée en uracile. La réaction globale est appelée une désamination car elle supprime un groupe amino.
Si une cytosine dans l'ADN est désaminée en uracile, l'uracile spécifiera l'incorporation d'une adénine dans le brin fille pendant la réplication au lieu de la guanine qui aurait été spécifiée par la cytosine. Cela aurait des effets indésirables car cela entraînerait des changements dans la séquence nucléotidique et pourrait provoquer des mutations des paires de bases GC en paires de bases AT. Afin d'éviter de telles complications, la présence d'un U dans l'ADN est reconnue comme une « erreur » par les enzymes cellulaires avant qu'une base incorrecte puisse être insérée dans le brin fille. L'uracile-N-glycolsylase et la dUTPase sont les deux enzymes qui assurent l'élimination de l'U de l'ADN. dUTPase clive les molécules UTP présentes dans le noyau et les empêche d'entrer dans le site actif de l'ADN polymérase. En cas d'incorporation de U dans l'ADN, l'uracile-N-glycolsylase clive la liaison glycosydique et élimine le nucléotide de l'ADN. Cela génère un site apyrimidinique qui est reconnu comme une lésion et qui est en outre réparé par des enzymes de réparation.
Si les U se trouvaient normalement dans l'ADN, les enzymes ne pourraient pas faire la distinction entre un U normal et un U formé par désamination de la cytosine. Avoir des T à la place des U dans l'ADN permet aux U qui se trouvent dans l'ADN d'être reconnus comme des erreurs. Contrairement à l'ADN, qui se réplique, toute erreur dans l'ARN ne survit pas longtemps car l'ARN est constamment dégradé puis resynthétisé à partir de la matrice d'ADN. Par conséquent, cela ne vaut pas la peine de dépenser de l'énergie supplémentaire pour incorporer les T dans l'ARN.

Propriétés des acides nucléiques :
Effet de la température
Les structures d'acide nucléique duplex sont perturbées ou dénaturées à haute température en molécules simple brin et le processus est appelé « fusion », le processus de fusion des doubles hélices peut être facilement surveillé car l'empilement des bases et les interactions d'appariement des bases réduisent considérablement l'absorption UV. Lorsque la température d'une solution contenant un duplex de polynucléotide est élevée, l'absorption de la lumière UV augmentera considérablement autour de la température à laquelle les deux brins se séparent en polynucléotides simple brin. Cela est dû au fait que les molécules simple brin présentent une absorption UV plus élevée que les molécules double brin à une longueur d'onde de 260 nm. La transition dans l'absorption UV se produit typiquement sur une plage de 48 °C à 88 °C. Lorsqu'un tracé est tracé avec l'absorbance sur l'axe X et la température sur l'axe Y, il est appelé courbe de fusion. Le point médian de la courbe de transition ou de fusion auquel la moitié de l'espèce polynucléotidique est duplex et la moitié est monocaténaire est identifié comme la température de fusion (Tm). En général, les duplex d'ADN sont relativement moins stables à la dénaturation thermique que les duplex d'ARN ou les duplex d'ARN-ADN.

Décalage hyperchrome : L'augmentation de l'absorption à 260 nm lors de la dénaturation de l'ADN double brin entraînant la formation d'ADN simple brin est appelée décalage hyperchromique.

Déplacement hypochrome : La diminution de l'absorption à 260 nm lors de la renaturation de molécules d'ADN simple brin pour produire de l'ADN double brin est appelée décalage hypochrome. La renaturation par refroidissement lent est appelée recuit.

La Tm pour un duplex donné est par ailleurs affectée par un certain nombre de facteurs. Les principaux déterminants comprennent la longueur de la séquence, la teneur en G-C et la concentration en sel. Les duplex plus longs ou ceux ayant une proportion plus élevée de paires G-C sont plus stables et auront donc une Tm plus élevée. Les cations monovalents, tels que le sodium (Na+) et le potassium (K+), stabilisent les doubles hélices en neutralisant partiellement la charge négative le long du squelette phosphodiester. Par conséquent, une concentration en sel plus élevée augmentera également la Tm d'un duplex polynucléotidique donné. De plus, la présence de bases mésappariées dans un duplex aura généralement un effet déstabilisant et diminuera la Tm.

  1. Absorbance A 260 nm par ordre décroissant.
    L'absorbance des nucléotides libres est plus leurs formes polymères et les molécules simple brin absorbent plus que les formes double brin. De même, l'absorption de l'ARN est supérieure à celle de l'ADN en raison de la présence du groupe 2'-OH. Les purines absorbent plus que les pyrimidines en raison de la présence d'une structure à double cycle. Parmi les purines, l'Adénine absorbe plus que la Guanine en raison de la présence de plus d'électrons libres. Par conséquent, deux molécules d'ADN de longueur égale mais de contenu GC différent absorbent différemment, l'ADN ayant plus de contenu AT absorbant plus que l'ADN ayant plus de contenu GC.
    A260 : Nucléotides > ADN ss > ADN ds
    A260 : ARN > ADN
    A260 : Purines > Pyrimidines
    A260 : Adénine > Guanine > Thymine = Cytosine
  2. Pression osmotique augmente lors de la dénaturation. Les solvants et détergents organiques interfèrent avec les interactions hydrophobes et provoquent la dénaturation de l'ADN.
  3. Viscosité diminue lors de la dénaturation. Les solutions d'ADN sont très visqueuses et la viscosité élevée est due à la grande longueur et à la rigidité des molécules. Lors de la dénaturation, la viscosité diminue car l'ADN double brin est plus rigide et donc visqueux par rapport à l'ADN simple brin.
  4. Rotation optique devient plus négatif lors de la dénaturation car la lumière polarisée dans le plan se déplace légèrement vers la gauche (plus négative).
  5. Densité d'acides nucléiques augmente lors de la dénaturation car l'ADN double brin est moins dense par rapport à l'ADN simple brin car il occupe plus de masse par volume donné.

Effet du pH sur les acides nucléiques :
Les acides nucléiques sont stables entre une plage de pH de 5 à 9. Au-delà de cette plage, elles subissent une dénaturation spontanée due au déplacement tautomère des bases azotées altérant la liaison H entre les nucléotides des brins opposés.

Effet de l'acide sur les acides nucléiques :
L'ADN et l'ARN subissent tous deux une hydrolyse acide.Les liaisons glycosidiques des nucléosides puriques sont sensibles à l'hydrolyse acide par protonation en N7 de la guanosine ou de l'adénosine. Dans des conditions légèrement acides, l'ADN devient de l'ADN apurinique. La dépurination de l'ADN est plus favorable que celle de l'ARN, bien que la formation d'un site abasique dans le polynucléotide entraîne dans les deux cas. Une perte complète d'informations de séquence représentée par un site abasique dans l'ADN peut également provoquer une mutation permanente.

Effet de l'alcali sur les acides nucléiques :
L'ARN subit une hydrolyse alcaline en raison de la présence du groupe 2'-OH, mais l'ADN ne subit pas d'hydrolyse alcaline.
Bien que l'ARN et l'ADN puissent être dégradés par clivage du squelette phosphodiester, leur stabilité chimique est radicalement différente. L'ARN est typiquement soumis à une réaction de transestérification dans laquelle l'oxygène C2' sert de nucléophile pour l'attaque du phosphore adjacent. Cette réaction particulière passe par un intermédiaire phosphate pentacoordonné, dans lequel la liaison formée entre l'oxygène C2' et le centre phosphore qui est en ligne avec la liaison à rompre entre le centre phosphore et l'oxygène C5'. En conséquence, les produits de réaction se terminent par un hydroxyle C5' et un phosphate cyclique C2',C3'. Ce mécanisme de cyclisation de la transestérification de l'ARN se produit facilement car le nucléophile est positionné de manière inhérente à proximité du centre du phosphore dans le squelette phosphodiester. De plus, la réaction est favorisée soit par la déprotonation de l'hydroxyle C2', soit par la protonation de l'oxygène C5'. Par conséquent, les ARN sont facilement dégradés dans les solutions alcalines ou acides. Un mécanisme similaire, applicable à la fois aux polymères d'ARN et d'ADN, opère pour le clivage du phosphodiester, dans lequel une deuxième molécule sert de nucléophile attaquant. La réaction est également favorisée par la déprotonation du groupe attaquant et la protonation du groupe partant. Cependant, les produits se terminent par un phosphate C5' et un hydroxyle C3'. L'eau peut servir de nucléophile dans la dégradation hydrolytique spontanée des polymères d'ARN ou d'ADN, bien que la réaction soit environ 100 000 fois moins susceptible de se produire que la transestérification de l'ARN. Sur la base du principe ci-dessus et du fait que chaque sucre n'a pas de groupe hydroxyle C2 ', le squelette phosphate et sucre de l'ADN présente une stabilité chimique relativement importante. En fait, l'ADN est le plus stable des polymères biologiques, ce qui lui permet de maintenir l'intégrité de l'information génétique, une condition préalable pour agir en tant que matériel génétique.

Effet du bisulfite et de l'acide nitreux :
Le bisulfite et l'acide nitreux favorisent la désamination ou l'élimination d'un groupe amino de la cytosine, entraînant la conversion de la cytosine en uracile. Dans l'ADN, la désamination de la cytosine conduira finalement à la conversion d'une paire de bases G-C en une paire de bases A-T si elle n'est pas corrigée.

Effet des rayonnements ionisants et des agents oxydants :
Les agents oxydants forts tels que les radicaux hydroxyles générés par les rayonnements ionisants ou la réduction métabolique incomplète de l'oxygène produisant des ions superoxydes, le peroxyde d'hydrogène ou les radicaux hydroxyles réagissent extrêmement avec l'ADN. Les radicaux hydroxyles peuvent endommager de manière non spécifique l'ADN en brisant le squelette phosphodiester. La scission de brin se produit par un certain nombre de mécanismes, dont chacun produit des fragments de polynucléotides avec différents produits terminaux 5' et 3'. De plus, les radicaux hydroxyles peuvent directement attaquer et altérer la composition chimique des bases dans les acides nucléiques générant des composés comme la 8-hydroxyguanine et la thymine glycol. Ces modifications entraînent la formation de lésions dans la séquence d'ADN les rendant sensibles aux mutations, qui peuvent finalement conduire au cancer. Par conséquent, les rayonnements ionisants et d'autres composés qui causent des dommages à l'ADN sont généralement cancérigènes ou cancérigènes.


Mécanisme d'action

Le DTT est impliqué dans les réactions d'échange de disulfure. Le DTT est utilisé à 1-10 mM pour la réduction de la protéine SS et est capable de traverser les membranes biologiques.

Propriétés réductrices

Le dithiothréitol est un agent réducteur puissant avec un potentiel redox de -0,33 V à pH 7. La réduction d'une liaison disulfure est suivie de deux réactions séquentielles d'échange thiol-disulfure (voir Fig. 2 ci-dessous). La réduction se poursuit généralement au-delà de l'espèce disulfure mixte en raison du deuxième thiol dans le DTT ayant une tendance accrue à fermer le cycle. Cela provoque la formation d'un DTT oxydé et laisse derrière lui une liaison disulfure réduite. Le pouvoir réducteur du DTT est limité à des valeurs de pH supérieures à 7, car seule la forme thiolate chargée négativement est réactive. Les groupes thiol ont des valeurs de pKa de 9,2 et 10,1.

2 : Réduction d'une liaison disulfure typique par DTT via deux réactions séquentielles d'échange thiol-disulfure


PROCÉDURES DE LABORATOIRE

Extraction d'ADN

Les étapes clés menant à des extractions d'ADN réussies sont le broyage suffisant du tissu et l'identification du ou des meilleurs protocoles d'extraction pour le but recherché. La disponibilité de l'équipement et de l'infrastructure de laboratoire est également un facteur à prendre en compte : des suggestions pour un ensemble minimal d'équipements de laboratoire et de protocoles de biologie moléculaire de base sont données à l'annexe 1.

Un broyage efficace des tissus végétaux est la première étape vers des rendements élevés d'ADN. Pour une homogénéisation efficace et simultanée de plusieurs échantillons de tissus, nous avons utilisé une version modifiée d'un broyeur basé sur une scie alternative (Alexander et al., 2007 Annexe 1) comme alternative peu coûteuse aux batteurs à billes disponibles dans le commerce. Des pilons et des mortiers avec l'ajout de sable d'argent de qualité moléculaire pour faciliter le broyage à la main peuvent être utilisés comme alternative. Si une taille d'échantillon minimale est nécessaire et que les tissus sont mous, ils peuvent être broyés dans des tubes de microcentrifugation avec des micropilons (par exemple, catalogue Geneaid n° MP050 Geneaid Biotech Ltd., New Taipei City, Taiwan).

Le protocole d'extraction de l'ADN doit être soigneusement étudié. Les plantes, en particulier les plantes tropicales, synthétisent une large gamme de composés, tels que les polysaccharides et les polyphénols (Coley et Barone, 1996), qui peuvent être co-purifiés avec l'ADN et peuvent réduire le rendement et/ou inhiber les réactions de PCR ultérieures. Dans certains cas, le protocole d'extraction devra être adapté pour répondre aux défis spécifiques du tissu, et il peut être difficile de trouver une méthode unique qui fonctionne bien pour tous les échantillons.

Les méthodes d'extraction d'ADN les plus largement utilisées peuvent être classées dans l'un des deux groupes suivants : celles qui utilisent des colonnes de liaison à l'ADN pour purifier l'ADN et celles qui utilisent des méthodes chimiques pour séparer l'ADN du contenu cellulaire en solution. Les colonnes de liaison à l'ADN sont fiables et produisent des résultats cohérents, nécessitent moins d'expertise technique pour être utilisées efficacement et génèrent peu ou pas de déchets dangereux. Le principal inconvénient est qu'ils peuvent être coûteux, bien que des versions moins chères soient disponibles et qu'il faille tenir compte des économies de temps et de main-d'œuvre réalisées avec les kits.

Si une méthode basée sur la partition est choisie, nous vous recommandons de rechercher dans la littérature les succès obtenus en utilisant cette méthode particulière pour extraire l'ADN de taxons étroitement liés ou de taxons présentant des défis d'extraction similaires (par exemple, un excès de polysaccharides). Il existe de nombreuses méthodes simples d'extraction d'ADN qui ont été utilisées avec succès sur une variété d'échantillons, notamment la noix de cajou et le maïs (Sika et al., 2015 ), la pomme de terre (Hosaka, 2004 ), les rosacées (Antanaviciute et al., 2015 ) et le riz ( Sajib et al., 2017 ) qui pourraient être testés et pourraient être couronnés de succès. Sinon, une méthode CTAB modifiée en ajoutant des agents pour éliminer des métabolites secondaires spécifiques est un bon point de départ voir Allen et al. ( 2006 ) et Neubig et al. (2014). Bon nombre de ces méthodes nécessitent des produits chimiques toxiques tels que le phénol et le chloroforme, qui doivent être manipulés sous une hotte et éliminés en toute sécurité conformément aux réglementations locales en utilisant des protocoles établis. Les fiches de données de sécurité (FDS) qui accompagnent tous les produits chimiques achetés et sont disponibles en ligne (par exemple, sur www.sigmaaldrich.com) sont une bonne source d'informations sur la sécurité.

Pour trouver le meilleur protocole d'extraction pour nos besoins, nous avons évalué deux méthodes CTAB relativement peu coûteuses et raisonnablement simples, modifiées pour être effectuées dans des tubes à centrifuger. Ces deux protocoles ont été utilisés avec succès par le Laboratoire de Systématique Moléculaire LIPI pour des projets spécifiques à des taxons. Initialement, nous avons extrait l'ADN des tissus de 75 spécimens en utilisant la méthode d'extraction de Tel-Zur et al. ( 1999 ), modifié par Wendel (Annexe 1). Après PCR, 63 échantillons n'ont pas donné assez de produit PCR pour le séquençage à la fois rbcL et matK (discuté en détail ci-dessous). Par conséquent, nous avons extrait l'ADN de ces échantillons et de 331 autres, en utilisant la méthode d'extraction de Porebski et al. ( 1997 ), qui générait un volume de déchets chimiques dangereux plus faible mais comportait une étape de nuit supplémentaire par rapport à la méthode d'extraction Wendel (Annexe 1). Au total, nous avons extrait l'ADN des tissus de 406 spécimens. Pour une comparaison supplémentaire, nous avons utilisé le kit DNeasy Plant Mini sur colonne (QIAGEN, Venlo, Pays-Bas Annexe 1) pour extraire les ADN des tissus d'un sous-ensemble de 48 échantillons qui ont été précédemment soumis à des extractions CTAB. Le flux de travail de biologie moléculaire que nous avons utilisé est illustré à la figure 1, les méthodes d'extraction d'ADN sont détaillées à l'annexe 1 et les données d'extraction d'ADN sont présentées à l'annexe S1.

Deux approches générales sont largement utilisées pour déterminer la quantité et la qualité des extraits d'ADN. L'électrophorèse sur gel d'échantillons d'ADN et une échelle de quantification permettent d'estimer les concentrations d'ADN et de déterminer si l'échantillon est dégradé ou contient principalement des fragments de poids moléculaire élevé. La spectrophotométrie permet d'estimer la quantité ainsi que l'identification de certains contaminants courants tels que les protéines et le phénol. Nous avons utilisé l'électrophorèse sur gel car nous n'avions pas accès à un spectrophotomètre approprié. Nous avons tenté la PCR pour tous les échantillons, indépendamment des preuves de dégradation de l'ADN ou du faible rendement que nous avons obtenu à partir du gel, bien qu'un succès moindre de la PCR soit attendu des tentatives d'amplification de loci à partir d'ADN hautement dégradés.

Amorces PCR et amplification

Les amorces publiées et spécifiques au taxon pour le groupe d'intérêt sont un bon point de départ pour les études axées sur le clade. Si de telles amorces ne sont pas disponibles ou, comme c'est le cas dans notre étude, un large éventail de taxons est à l'étude, des amorces universelles conçues pour fonctionner sur des taxons phylogénétiquement divers sont une bonne option (par exemple, celles recommandées par le CBOL Plant Working Group 2009 ). Les critères pour les amorces recommandées par le CBOL sont basés sur l'universalité (amplification réussie sur plusieurs taxons), la qualité et la couverture de la séquence (amplification des régions qui renvoient des données de séquence de haute qualité) et la discrimination (permettent de distinguer le plus d'espèces). Les séquences d'amorces spécifiques à un taxon pertinentes peuvent toujours être utiles pour le dépannage si le projet a une large portée mais que des résultats PCR médiocres sont associés à des taxons particuliers. Si ces approches ne réussissent pas, des amorces peuvent être conçues sur la base de données de séquence accessibles au public. Idéalement, les alignements de séquences devraient être générés à partir de plusieurs taxons liés aux taxons cibles afin que les régions conservées appropriées puissent être identifiées comme sites d'amorce. Des amorces peuvent ensuite être conçues pour amplifier la région d'intérêt à l'aide de logiciels tels que PrimerDesign (Brodin et al., 2013 ) ou Primaclade (Gadberry et al., 2005 ). Lorenz ( 2012 ) propose des directives générales pour la conception d'amorces PCR.

La PCR peut être difficile et, afin d'obtenir une amplification reproductible, il est essentiel d'utiliser des ADN de haute qualité dans la mesure du possible et de toujours utiliser des amorces bien conçues et des réactifs correctement préparés et stockés. Le stockage de l'ADN est difficile (Anchordoquy et Molina, 2007) et est discuté en détail, ainsi que des détails sur l'utilisation de congélateurs sans givre pour le stockage de l'ADN et d'autres réactifs, à l'annexe 1. La qualité de l'eau est souvent un problème, et si elle est fiable Milli-Q (MilliporeSigma, Burlington, Massachusetts, USA) ou une eau équivalente n'est pas disponible, il est recommandé d'acheter de l'eau de qualité biologie moléculaire auprès d'une société de réactifs fiable.

Nous avons sélectionné des amorces PCR pour les codes-barres d'ADN végétal rbcL et matK sur la base des recommandations du groupe de travail sur les plantes CBOL (2009). L'annexe 1 détaille les séquences d'amorces et les conditions de PCR. Nous avons effectué deux réactions PCR de 12,5 μL pour chaque échantillon d'ADN extrait à l'aide d'un protocole basé sur CTAB (Fig. 1). Deux réactions de petit volume ont été utilisées au lieu d'une réaction de grand volume pour donner deux tentatives indépendantes d'amplification tout en conservant des réactifs PCR coûteux. Les produits de PCR ont été examinés en utilisant une électrophorèse sur gel comme décrit ci-dessus. Si aucun produit de PCR n'a été généré après deux tentatives, aucune autre PCR n'a été effectuée. Cependant, si un produit était présent, des PCR supplémentaires ont été effectuées jusqu'à ce qu'il y ait suffisamment d'ADN pour le séquençage. Il existe des compromis associés à la réalisation de PCR supplémentaires pour obtenir suffisamment de produit par rapport à la tentative d'optimisation du protocole PCR pour des combinaisons de matrice et d'amorce qui produisent des rendements marginaux. L'optimisation peut ne pas être pratique lorsqu'un projet, comme dans ce cas, échantillonne des individus d'une région ou d'une communauté. Cependant, lors de l'échantillonnage de taxons étroitement apparentés, l'optimisation pourrait finalement économiser du temps et des ressources. Des suggestions d'optimisation et de dépannage se trouvent à l'annexe 1.

Obtenir rbcL codes-barres, nous avons effectué jusqu'à quatre réactions PCR sur 75 échantillons d'ADN extraits selon le protocole Wendel et jusqu'à six réactions PCR sur 386 échantillons ADN extraits selon le protocole Porebski (55 échantillons représentent des extractions de spécimens préalablement extraits avec le protocole Wendel Fig. 1) . Au total, nous avons tenté de générer rbcL codes-barres de 406 spécimens (annexe S1). Nous avons utilisé l'électrophorèse sur gel pour déterminer le rendement de la PCR, nous avons attribué les rendements à des catégories qualitatives afin de déterminer quels échantillons d'ADN devraient être la cible de réactions PCR supplémentaires pour accumuler suffisamment d'ADN pour le séquençage. Les catégories que nous avons utilisées étaient « pas de produit » lorsqu'il n'y avait pas de bande de produit visible « un certain produit » lorsqu'une bande faible de la taille attendue était visible et « produit adéquat » lorsqu'une bande brillante de la taille attendue était visible. Ces catégories étaient basées sur des résultats empiriques du séquençage des bandes faibles par rapport aux bandes lumineuses. Nous avons utilisé les mêmes catégories que celles décrites ci-dessus pour classer l'ADN regroupé à partir de plusieurs réactions PCR afin d'envoyer des échantillons pour le séquençage (Fig. 1). Quelle que soit la méthode d'extraction d'ADN utilisée, nous devions le plus souvent effectuer trois ou quatre réactions PCR de 12,5 μL pour obtenir suffisamment de produit PCR pour le séquençage. Sur les 75 échantillons extraits avec le protocole Wendel, 19 ont été séquencés, et sur les 386 échantillons extraits avec le protocole Porebski, 76 ont été séquencés. Un résumé de ces données est présenté à la figure 2. Deux autres échantillons ont été séquencés en regroupant les produits PCR des extractions Wendel et Porebski, donnant un total de 97 codes-barres générés à partir de 406 échantillons (24 %).

Obtenir matK codes-barres, nous avons réalisé jusqu'à six réactions PCR sur 73 échantillons extraits selon le protocole Wendel et jusqu'à sept réactions PCR sur 386 échantillons extraits selon le protocole Porebski (56 échantillons représentent des extractions de spécimens préalablement extraits avec le protocole Wendel Fig. 1). Au total, nous avons tenté de générer matK codes-barres de 405 spécimens (annexe S1). Comme décrit ci-dessus, les produits de PCR pour chaque méthode d'extraction ont été divisés en trois catégories (aucun produit, un peu de produit et un produit adéquat) sur la base du rendement estimé par électrophorèse sur gel. Les résultats de la PCR sont résumés dans la figure 2. Nous devions le plus souvent effectuer deux (Wendel) ou quatre (Porebski) réactions PCR de 12,5 L par échantillon pour obtenir suffisamment de produit pour le séquençage. Sur les 73 échantillons extraits avec le protocole Wendel, 18 ont été séquencés, et sur les 386 échantillons extraits avec le protocole Porebski, 116 ont été séquencés. Dix autres spécimens ont été séquencés à partir des produits regroupés des extractions de Wendel et de Porebski, donnant un total de 144 codes-barres à partir de 405 spécimens (35 %). Dans l'ensemble, les méthodes d'extraction d'ADN de Wendel et Porebski ont donné des résultats similaires (Fig. 2).

Les ADN extraits à l'aide du protocole QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit (Annexe 1) ont chacun fait l'objet d'une seule réaction PCR (Fig. 1). Une seule réaction PCR à partir de l'ADN extrait au CTAB correspondant a été réalisée en même temps. Comme précédemment, les produits de PCR ont été divisés en trois catégories (aucun produit, un peu de produit, produit adéquat) sur la base du rendement estimé par électrophorèse sur gel. Le succès de ces réactions PCR uniques pour matK et rbcL sont illustrés à la figure 3 et les détails complets sont donnés à l'annexe S1. En termes d'ADN qui pourraient être utilisés pour générer un produit PCR, l'ADN extrait par QIAGEN s'est comporté de manière similaire à l'ADN extrait par CTAB. En utilisant les ADN extraits à l'aide du kit QIAGEN, nous avons généré 18 rbcL séquences pour donner un total de 115/406 spécimens (28%) et 10 matK séquences pour donner un total de 154/405 spécimens (38%). Les accessions GenBank sont données à l'annexe S1.

Bien que les taux d'échec de la PCR semblent élevés, les échantillons contenant au moins une partie du produit de PCR (Fig. 2, Annexe S1) pourraient probablement être séquencés après optimisation de la PCR pour augmenter le rendement. Au total, 51 échantillons avaient un produit PCR pour rbcL (combiné à partir des trois méthodes d'extraction d'ADN). L'optimisation de la PCR et le séquençage réussi de celles-ci augmenteraient le taux de réussite global à 41 %. De même, il y avait 75 spécimens pour matK, qui, s'il était séquencé avec succès, augmenterait le taux de réussite global à 57 %.

Comme discuté ci-dessus, les groupes taxonomiques végétaux diffèrent par la présence de composés qui entravent l'extraction et l'amplification de l'ADN, et les amorces universelles peuvent ne pas fonctionner pour toutes les familles. Par conséquent, nous nous attendions à ce que notre succès global varie selon les familles de plantes. Nous avons trouvé une association significative entre la famille taxonomique et le succès global de la génération de codes-barres ADN pour les deux matK et rbcL (respectivement, ?? 2 = 57.6, df = 11, P = 2.57 × 10 −8 ?? 2 = 25.5, df = 11, P = 0,00768 Tableau 1, Annexe S1). Il est important de noter l'échec quasi total des échantillons de Clusiaceae et Phyllanthaceae pour les deux marqueurs, et les différences de succès entre matK et rbcL pour les Annonacées et les Myristicacées.

Famillea une Les familles différaient significativement du taux de réussite (matK: ?? 2 = 57.6, df = 11, P = 2.57 × 10 -8 rbcL: ?? 2 = 25.5, df = 11, P = 0,00768). Voir l'annexe S1 pour les listes complètes de réussite par famille.
matK rbcL
Code-barres généré Code-barres non généré Code-barres généré Code-barres non généré
Annonacées 18 9 1 26
Apocynacées 7 7 3 11
Clusiacées 0 11 1 10
Diptérocarpacées 12 8 8 12
Lauracées 6 5 1 10
Méliacées 7 8 6 9
Moracées 7 14 7 14
Myristicacées 12 2 0 14
Phyllanthacées 1 30 7 24
Primulacées 4 9 5 8
Rubiacées 7 28 9 26
Autre 73 120 67 127
LE TOTAL 154 251 115 291
  • une Les familles différaient significativement du taux de réussite (matK: ?? 2 = 57.6, df = 11, P = 2.57 × 10 -8 rbcL: ?? 2 = 25.5, df = 11, P = 0,00768). Voir l'annexe S1 pour les listes complètes de réussite par famille.

Dans l'ensemble, nos données suggèrent que plusieurs méthodes d'extraction peuvent être utilisées avec succès, indiquant que d'autres facteurs, tels que les coûts des kits, l'accès aux produits chimiques et à l'infrastructure appropriés, et une expérience réussie antérieure avec des échantillons similaires, doivent être pris en compte lors du choix d'une méthode.

Réduire la contamination

La contamination peut être un problème majeur dans tout laboratoire de biologie moléculaire.Les produits de PCR précédemment amplifiés sont particulièrement préoccupants car ils peuvent s'amplifier beaucoup plus facilement que le locus cible d'origine, qui peut être situé dans un long fragment d'ADN génomique. Le laboratoire doit être aménagé de manière à minimiser le risque de contamination. Idéalement, il devrait y avoir des salles séparées avec des équipements et des micropipettes séparés pour l'extraction d'ADN par rapport à la PCR et à tous les processus post-PCR. Si cela n'est pas possible, des zones séparées du laboratoire avec des micropipettes séparées doivent être utilisées pour l'extraction d'ADN et la PCR. Les pointes filtrantes réduisent efficacement la quantité de contamination croisée par les aérosols pendant le pipetage et doivent être utilisées dans la mesure du possible. Le surcoût des pointes de filtre est compensé par la réduction de la génération de données inutilisables. Les pipettes doivent être nettoyées régulièrement et des gants neufs doivent être portés en permanence et changés fréquemment. Il est très facile pour les fluides, ou les aérosols de fluides, d'adhérer à la peau ou aux gants et d'être transférés à l'étape de traitement suivante. Des précautions doivent être prises lors de la manipulation des échantillons afin de ne pas répandre des fragments de feuilles autour de la zone de travail ou de contaminer les échantillons. Les pinces pour les manipulations d'échantillons peuvent être stérilisées par flambage ou nettoyées dans de l'alcool. Des contrôles négatifs (mélanges réactionnels complets sans matrice d'ADN) doivent être inclus dans chaque série de réactions PCR pour permettre de détecter rapidement la contamination avant d'effectuer un séquençage coûteux. La tenue d'enregistrements détaillés dans des journaux de bord sur toutes les expériences de PCR est indispensable à la tâche de trouver la source de contamination. Si l'accès au traitement automatisé des échantillons est disponible, cela présente d'autres possibilités de réduction de la contamination ainsi que d'augmentation de la reproductibilité.

Séquençage ADN

Le coût du séquençage de l'ADN continue de baisser et de plus en plus de services et de plateformes de séquençage deviennent disponibles. Le séquençage à haut débit des codes-barres (par exemple, Liu et al., 2017 ) et le méta-codage à barres (Deiner et al., 2017 ) sont de bonnes options pour les projets de codes-barres qui ciblent un très grand nombre d'échantillons et/ou de réseaux écologiques. Même le séquençage au fusil de chasse du génome entier à faible couverture pour « écrémer » les loci nucléaires organellaires et à copie élevée à partir des lectures de séquençage devient rentable (Twyford et Ness, 2017). Pour les projets qui ciblent un petit nombre de codes-barres à partir de spécimens comptant des centaines à quelques milliers, le séquençage Sanger reste une option raisonnable. La principale décision est d'externaliser le séquençage des codes-barres générés par PCR ou de le compléter au sein de l'institution. Nous recommandons l'externalisation vers un service de séquençage abordable et de haute qualité, car il est souvent moins cher que d'importer des réactifs, d'effectuer des réactions répétées et de dépanner, et de maintenir les instruments. Les services de séquençage sont également bien mieux placés que les laboratoires individuels pour suivre le rythme rapide des changements technologiques dans les approches de séquençage de l'ADN. Diverses sociétés proposent un séquençage en un seul passage à partir de 3 $ US par échantillon. Il existe généralement des remises encore plus importantes pour la soumission d'un plus grand nombre d'échantillons au format plaque, et la livraison gratuite est disponible pour la soumission d'un nombre d'échantillons plus important, mais toujours modeste. Des services supplémentaires tels que la purification de produits PCR sont également proposés par de nombreuses entreprises, ce qui peut être plus rentable que l'importation de réactifs. Contrairement aux spécimens ou à l'ADN génomique, les produits PCR pour le séquençage de l'ADN peuvent généralement être envoyés hors du pays d'origine car les échantillons ne sont qu'un petit fragment du génome, qui ne peut pas être utilisé à d'autres fins, et la réaction de séquençage utilise tout l'échantillon. . Nous avons utilisé le service de séquençage Sanger de Macrogen Korea, où les exigences pour la soumission d'échantillons étaient de 25 L de produit à 100 ng/μL, plus 2 μL d'amorce de séquençage à 10 pmol/μL. Macrogen propose également une option de synthèse d'amorces à un prix raisonnable. La livraison est gratuite pour plus de 20 réactions, et une réaction répétée gratuite est fournie pour les échantillons ayant échoué, ce qui en fait un moyen très rentable de générer des données de séquence pour un laboratoire à petite échelle.

Des données de séquençage de haute qualité peuvent généralement être obtenues lorsque les normes de quantité et de qualité appropriées sont respectées, bien que certaines caractéristiques de séquence (par exemple, une teneur élevée en GC et la présence de répétitions de séquences simples) puissent interférer. Des directives pour la quantité et la qualité sont généralement disponibles auprès des services de séquençage, et une excellente ressource pour le dépannage des traces de séquences d'ADN a été mise à disposition par le Nucleic Acid PCR Research Core Facility (NAPCore Facility, Philadelphie, Pennsylvanie, États-Unis https://napcore.research. chop.edu/problems.php).


Applications

Le séquençage de l'ADN par microscopie électronique à transmission n'est pas encore disponible dans le commerce, mais les longues longueurs de lecture que cette technologie pourrait un jour fournir le rendront utile dans une variété de contextes.

De novo assemblage du génome

Lors du séquençage d'un génome, il doit être décomposé en morceaux suffisamment courts pour être séquencés en une seule lecture. Ces lectures doivent ensuite être reconstituées comme un puzzle en alignant les régions qui se chevauchent entre les lectures. Ce processus est appelé de novoassemblage du génome. Plus la longueur de lecture fournie par une plate-forme de séquençage est longue, plus les régions qui se chevauchent sont longues et plus il est facile d'assembler le génome. D'un point de vue informatique, le séquençage microfluidique de Sanger reste le moyen le plus efficace de séquencer et d'assembler des génomes pour lesquels il n'existe aucune séquence de génome de référence. Les longueurs de lecture relativement longues fournissent un chevauchement substantiel entre les lectures de séquençage individuelles, ce qui permet une plus grande confiance statistique dans l'assemblage. De plus, les longues lectures de Sanger sont capables de couvrir la plupart des régions de séquences d'ADN répétitives qui, autrement, confondent l'assemblage de séquences en provoquant de faux alignements. Cependant, de novo l'assemblage du génome par séquençage de Sanger est extrêmement coûteux et prend beaucoup de temps. Les technologies de séquençage de deuxième génération, [19] bien que moins coûteuses, sont généralement inadaptées aux de novo assemblage du génome en raison des courtes longueurs de lecture. En général, les technologies de séquençage de troisième génération, [11] y compris le séquençage d'ADN par microscopie électronique à transmission, visent à améliorer la longueur de lecture tout en maintenant un faible coût de séquençage. Ainsi, à mesure que les technologies de séquençage de troisième génération s'améliorent, des de novo l'assemblage du génome deviendra une réalité.

Haplotypes complets

Un haplotype est une série d'allèles liés qui sont hérités ensemble sur un seul chromosome. Le séquençage de l'ADN peut être utilisé pour génotyper tous les polymorphismes nucléotidiques simples (SNP) qui constituent un haplotype. Cependant, les lectures de séquençage d'ADN courtes ne peuvent souvent pas être phasées, c'est-à-dire que les variants hétérozygotes ne peuvent pas être attribués en toute confiance à l'haplotype correct. En fait, l'haplotypage avec des données de séquençage d'ADN à lecture courte nécessite une couverture très élevée (couverture moyenne >50x de chaque base d'ADN) pour identifier avec précision les SNP, ainsi que des données de séquence supplémentaires des parents afin que la transmission mendélienne puisse être utilisée pour estimer les haplotypes. [20] Les technologies de séquençage qui génèrent de longues lectures, y compris le séquençage d'ADN par microscopie électronique à transmission, peuvent capturer des haploblocs entiers en une seule lecture. C'est-à-dire que les haplotypes ne sont pas divisés entre plusieurs lectures et que les allèles génétiquement liés restent ensemble dans les données de séquençage. Par conséquent, les longues lectures rendent l'haplotypage plus facile et plus précis, ce qui est bénéfique pour le domaine de la génétique des populations.

Copier les variantes de nombre

Les gènes sont normalement présents en deux copies dans les gènes du génome humain diploïde qui s'écartent de ce nombre de copies standard sont appelés variantes du nombre de copies (CNV). La variation du nombre de copies peut être bénigne (ce sont généralement des variantes courantes, appelées polymorphismes du nombre de copies) ou pathogènes. [21] Les CNV sont détectés par hybridation in situ en fluorescence (FISH) ou hybridation génomique comparative (CGH). Pour détecter les points d'arrêt spécifiques auxquels une délétion se produit, ou pour détecter des lésions génomiques introduites par un événement de duplication ou d'amplification, la CGH peut être effectuée à l'aide d'une matrice de pavage (array CGH), ou la région variante peut être séquencée. Les lectures de séquençage longues sont particulièrement utiles pour analyser les duplications ou les amplifications, car il est possible d'analyser l'orientation des segments amplifiés s'ils sont capturés en une seule lecture de séquençage.

Cancer

La génomique du cancer, ou oncogénomique, est un domaine émergent dans lequel la technologie de séquençage d'ADN de deuxième génération à haut débit est appliquée pour séquencer des génomes cancéreux entiers. L'analyse de ces données de séquençage de lecture courte englobe tous les problèmes associés à de novo assemblage du génome à l'aide de données de lecture courtes. [22] De plus, les génomes cancéreux sont souvent aneuploïdes. [23] Ces aberrations, qui sont essentiellement des variantes du nombre de copies à grande échelle, peuvent être analysées par des technologies de séquençage de deuxième génération utilisant la fréquence de lecture pour estimer le nombre de copies. [22] Des lectures plus longues fourniraient cependant une image plus précise du nombre de copies, de l'orientation des régions amplifiées et des SNP présents dans les génomes du cancer.

Séquençage du microbiome

Le microbiome fait référence à la collection totale de microbes présents dans un microenvironnement et à leurs génomes respectifs. Par exemple, on estime que 100 000 milliards de cellules microbiennes colonisent le corps humain à un moment donné. [24] Le microbiome humain présente un intérêt particulier, car ces bactéries commensales sont importantes pour la santé et l'immunité humaines. La plupart des génomes bactériens de la Terre n'ont pas encore été séquencés entreprendre un projet de séquençage du microbiome nécessiterait de vastes de novo l'assemblage du génome, une perspective intimidante avec les technologies de séquençage de l'ADN à lecture courte. [25] Des lectures plus longues faciliteraient grandement l'assemblage de nouveaux génomes microbiens.


Tendances récentes en biotechnologie animale

La biotechnologie animale a été définie de diverses manières. L'une des définitions les plus récentes citées de la biotechnologie animale est : « l'application de principes scientifiques et techniques au traitement ou à la production de matériaux par des animaux ou des espèces aquatiques pour fournir des biens et des services ».

La biotechnologie animale s'est développée rapidement depuis le début des années 1980, lorsque les premières souris transgéniques et les premiers embryons bovins produits in vitro ont été créés.

Une tentative a été faite dans le présent article pour décrire les sources d'information et les processus qui sont disponibles dans le domaine de la biotechnologie animale.

Des exemples de biotechnologie animale incluent la génération d'animaux transgéniques ou de poissons transgéniques utilisant la technologie de suppression de gènes pour générer des animaux dans lesquels un gène spécifique a été inactivé, la production d'animaux presque identiques par transfert nucléaire de cellules somatiques ou la production d'espèces aquatiques infertiles.

Pour répondre aux besoins de notre population en croissance rapide, la recherche de sources bon marché de protéines animales ou végétales a été la tâche la plus ardue pour nous. Les protéines animales sont une excellente source d'acides aminés alimentaires essentiels à la nutrition humaine. De plus, nous pouvons récolter de la viande, du lait et des fibres d'animaux vivants et les utiliser pour différents programmes de bien-être. La production d'aliments à partir d'animaux est chère et moins efficace que celle des plantes. Malgré ces inconvénients, nous continuons à élever des animaux sur une base commerciale pour la nourriture, les fibres et les sous-produits.

Nos ancêtres ont d'abord domestiqué les animaux il y a plusieurs milliers d'années et depuis lors, ils ont été nos compagnons constants. À partir de ce moment-là, les animaux eux-mêmes ont commencé à changer. Avec le passage du temps et l'isolement continu de leurs parents sauvages, les animaux domestiques ont commencé à présenter des caractéristiques différentes. Certains auraient produit plus ou mieux de lait que d'autres, certains auraient grandi plus vite ou auraient été plus féconds, certains auraient été plus vigoureux.

Nos ancêtres auraient pu remarquer ces variations et s'accoupler avec des animaux présentant des traits désirables similaires, mais ils l'ont fait sans comprendre la base de l'hérédité. L'élevage restrictif et l'accouplement sélectif ont progressivement conduit aux nombreuses races diverses de bétail que nous avons aujourd'hui, bien que la plupart des races de bovins domestiques dominants, Bos taurus, soient apparues au cours des deux derniers siècles. Des troupeaux d'espèces ancestrales, Bos primigenius, vivaient en Europe au XVIII e siècle.

Ainsi, l'amélioration animale n'est plus une question d'intérêt mais une question de nécessité. La biotechnologie nous fournit des outils puissants qui nous engagent à apprendre les bases de ces outils pour augmenter la production animale dans le monde entier. Dans cet article, je vais discuter de ce que sont ces outils et de leurs applications.

A. Reproduction chez les animaux/Technologie de la reproduction:

La reproduction a des rôles importants dans le système de production. Elle doit se produire à un rythme qui garantit que la reconstitution du stock est supérieure à son utilisation et améliore la qualité génétique du stock. L'objectif des technologies de reproduction est d'augmenter le nombre de descendants tout en améliorant la qualité génétique du cheptel en général et des animaux gérés de manière plus intensive comme les bovins laitiers et les porcs domestiques en particulier. Cela a été fait par diverses procédures telles que l'insémination artificielle, le transfert d'embryons, la fécondation in vitro et le clonage d'embryons.

A. 1. Insémination artificielle (IA) :

L'insémination artificielle, la première biotechnologie animale, tire parti de la capacité de production excédentaire de gamètes (sperme) des mâles. Cela a été le facteur le plus important dans l'augmentation de la productivité. Il existe de nombreuses variantes d'insémination artificielle à considérer. Il existe l'insémination artificielle animal-animal, l'insémination de sperme frais étendu (réfrigéré) et l'insémination de sperme congelé.

Avant l'insémination, le sperme éjaculé est collecté, dilué et examiné au microscope pour déterminer le nombre et la mortalité des spermatozoïdes. Les techniques d'IA comprennent le dépôt vaginal, l'implant chirurgical et l'insémination transcervicale. Des études ont été publiées avec des preuves convaincantes que chaque préparation de sperme frais, frais étendu ou congelé produira des portées plus importantes si le sperme est déposé dans l'utérus, en particulier avec la technique trans-cervicale. Le sperme frais et frais étendu produit de bons résultats avec le dépôt vaginal.

Pour les bovins, l'IA se fait sur des animaux debout sans anesthésie, en utilisant une procédure connue sous le nom de «palpation rectale». Parmi les différents types de préparation de semence, il est encore une fois évident que la collecte et l'insémination d'animal-animal frais donneront la meilleure préparation de semence. Le sperme frais étendu ou «réfrigéré» a très bien fonctionné pendant de nombreuses années, mais pas aussi bien que le sperme frais.

Les pires résultats sont avec le sperme congelé, quel que soit le processus utilisé pour la congélation. Les femelles sont inséminées après l'ovulation, qui ne dure que quelques heures et se produit le plus souvent la nuit. Dans de nombreuses races d'animaux de ferme, il est très difficile de détecter l'ovulation (œstrus).

L'alternative est d'inciter les femelles à ovuler de manière synchronisée. En pratique, il est plutôt impossible d'obtenir une synchronie totale de l'ovulation mais environ 80% des femelles répondraient à l'inducteur. Chez les ruminants, l'ovulation chez les femelles peut être induite par l'administration d'hormones comme la progestérone ou la prostaglandine.

Le sexe unique est préféré par toutes les industries de l'élevage. Chez les bovins laitiers et de boucherie, les femelles sont plus acceptées que les mâles parce que les femelles ne sont pas efficaces dans la reproduction et ont des caractéristiques de production souhaitables. La même chose se produit dans l'industrie porcine. Le sexe de l'embryon est déterminé uniquement par le sperme contenant soit le chromosome X, soit le chromosome Y.

Puisque la moitié des spermatozoïdes d'un éjaculat contiennent le X et l'autre moitié le Y, le sex-ratio de la descendance est proche de 1 : 1. Séparer les spermatozoïdes contenant le chromosome X de celui du Y permettrait de manipuler la descendance sexuelle en IA. La séparation des deux populations a été effectuée à l'aide d'un trieur de cellules activé par fluorescence (FACS). La méthode est très coûteuse et très lente aussi. Un anticorps monoclonal qui se lie spécifiquement aux spermatozoïdes porteurs de Y pourrait être utilisé à l'avenir pour séparer les spermatozoïdes porteurs de Y et porteurs de X. Le tri en flux des spermatozoïdes pour séparer les cellules porteuses X des cellules Y a été testé avec succès dans la plupart des cas et chez les bovins et les porcs a abouti à une progéniture du sexe souhaité.

A. 2. Transfert d'embryons :

La propagation d'animaux génétiquement précieux est améliorée par le transfert d'embryons. Pour ce faire, il faut augmenter le nombre d'œufs matures produits par une femelle sélectionnée. Après la fécondation, ces œufs fécondés sont implantés dans la mère nourricière, un pour chaque œuf. Les femelles donneuses reçoivent une injection de prostaglandine F2a (PGF2a) pour induire un œstrus synchronisé avant le début du traitement. Dix jours après la période œstrale, elles reçoivent une injection de FSH pendant une période de quatre jours, suivie de PGF2a pour induire l'œstrus.

Les donneurs superovulés sont ensuite accouplés par insémination artificielle. Six à huit jours après l'insémination, les œufs fécondés sont récupérés chez les bovins et six jours chez les ovins et caprins. Ils sont immédiatement transférés dans des destinataires synchronisés. Alternativement, ils peuvent être congelés pour un stockage indéfini. Avec de bonnes pratiques, des taux de gestation de 50 à 60 % peuvent être atteints chez les bovins à partir d'embryons transférés.

Les taux de grossesse peuvent être augmentés en divisant l'embryon, une méthode qui produit des jumeaux identiques. Récemment, cela est devenu un outil de production de routine, nécessitant un équipement de micromanipulation et une formation minimale. Des embryons ont été obtenus du donneur au stade blastocyste (Fig. 21.1) et transférés dans un milieu de culture cellulaire standard contenant du saccharose hypertonique et de l'albumine de sérum bovin.

L'embryon est ensuite transféré dans une boîte de Petridish en plastique contenant un milieu de culture standard, où il coule au fond et s'y colle. Cela se produit en raison des interactions électrostatiques entre la charge négative induite par la BSA sur la membrane externe et la charge positive du disque en plastique.

L'embryon est ensuite coupé en deux à l'aide d'un micromanipulateur équipé d'une lame fine sous le microscope inversé. Au cours de la division de l'embryon, il faut veiller à ce que la masse cellulaire interne soit divisée en moitiés égales. Après fractionnement, ils sont transférés dans l'oviducte de la femelle receveuse suivant la même procédure que pour le transfert normal. Une biopsie de routine a été réalisée pour déterminer le sexe de la descendance, un trait de production. La présence d'ADN chromosomique Y dans les cellules d'une biopsie embryonnaire indique que l'embryon est un mâle : si aucun ADN chromosomique Y n'est présent, il s'agit d'une femelle. Ceci est fait en utilisant la PCR pour amplifier l'ADN spécifique du chromosome Y.

UNE. 3 Fécondation In Vitro (FIV) :

Le transfert d'embryons n'est pas largement utilisé en raison de nombreux facteurs, notamment les coûts élevés, les difficultés techniques et la disponibilité limitée. Nous pouvons surmonter ces problèmes si les ovocytes, prélevés sur une femelle donneuse, sont fécondés in vitro. Cela garantirait la fécondation de plus d'œufs en utilisant moins de sperme. Ainsi, la FIV est une méthode plus efficace que l'IA. Au cours du cycle œstral, un certain nombre de follicules de De Graaf commencent à se développer.

Finalement, l'un des follicules mûrit et se rompt, libérant les œufs pour la fécondation. Les ovocytes sont récupérés à partir de ces follicules de donneurs super ovulés par chirurgie laparoscopique. Les œufs sont ensuite incubés pour être mûris et fécondés in vitro. Cette méthode exige des compétences techniques élevées et, par conséquent, n'est pas toujours rentable.

Le succès de la FIV dépend de la collecte d'un grand nombre d'ovocytes et de leur maturation in vitro. Cela peut être fait en enlevant un ovaire d'une femelle sélectionnée et est amené à mûrir in vitro. De nombreux scientifiques du monde entier ont mené des recherches sur la maturation des ovocytes in vitro. Cependant, il peut être intéressant de mentionner ici que la majorité des follicules de Graaf n'atteignent jamais la maturité. Les taux de réussite les plus élevés avec le transfert d'embryons sont signalés lorsque des blastocystes sont implantés dans des receveurs.

Cela peut être fait si les embryons sont maintenus en culture. De nombreux laboratoires ont montré que 60% des embryons de bovins FIV peuvent être cultivés jusqu'au stade blastocyste. Un taux élevé d'avortement est enregistré à partir d'embryons en culture au cours des deux premiers mois de la grossesse. Cela peut être dû à un défaut génétique de l'ovocyte et/ou de la fertilisation du sperme et à une mutagenèse environnementale de l'ovule, du sperme ou de l'embryon (principalement causée par les radicaux libres d'oxygène).

B. Clonage:

Une autre application de la biotechnologie animale est l'utilisation du transfert nucléaire somatique pour produire de multiples copies d'animaux qui ne sont que des copies identiques d'autres animaux. Ce processus est appelé ‘clonage’. Le clonage est donc la production d'une ou plusieurs plantes ou animaux identiques qui sont génétiquement identiques à une autre plante ou animal.

Cela faciliterait la production accrue de nombres d'un embryon particulier ayant des caractéristiques souhaitables. La nature elle-même est le plus grand agent de clonage. Dans environ une conception sur 75, l'embryon fécondé se divise et produit des jumeaux monozygotes.

B. 1. Clonage d'ADN :

Pour effectuer d'autres manipulations et analyses de molécules d'ADN recombinant individuelles (par exemple, l'ADN contenant le gène de l'insuline), nous devons avoir de nombreuses copies des molécules, généralement sous une forme purifiée. Le clonage d'ADN est une technique permettant de produire de grandes quantités de segment d'ADN spécifique. Le segment d'ADN à cloner est inséré dans un vecteur, qui est un véhicule pour transporter l'ADN inséré dans une cellule hôte appropriée, telle que la bactérie E. coli.

Le vecteur contient des séquences qui lui permettent d'être répliqué dans la cellule hôte et est généralement appelé vecteur de clonage. Il existe de nombreux vecteurs de clonage actuellement utilisés et leur choix dépend de la taille du fragment d'ADN à cloner ou de l'utilisation qui sera faite du clone.

Les plasmides bactériens sont de petites molécules d'ADN circulaires distinctes du chromosome bactérien principal. Ils répliquent leur ADN indépendamment du chromosome bactérien. Les plasmides couramment utilisés comme vecteurs sont ceux qui portent des gènes de résistance aux médicaments. Les gènes de résistance aux médicaments sont utiles car le phénotype de résistance aux médicaments peut être utilisé pour sélectionner les cellules qui contiennent le plasmide recombinant.

Le processus par lequel les cellules bactériennes absorbent l'ADN du milieu est appelé transformation. Ceci constitue la base du clonage du plasmide dans les cellules bactériennes (Fig. 21.2). Dans les méthodes les plus couramment utilisées, des plasmides recombinants sont ajoutés à une culture bactérienne qui a été prétraitée avec des ions calcium. Les cellules bactériennes sont ensuite activées (par choc thermique) pour absorber l'ADN du milieu.

Normalement, un petit nombre de cellules sont capables d'absorber et de retenir l'une des molécules plasmidiques recombinantes. Une fois qu'une cellule bactérienne a absorbé un plasmide recombinant du milieu, la cellule donne naissance à une colonie de cellules contenant la molécule d'ADN recombinant. Ces bactéries contenant un plasmide recombinant sont sélectionnées parmi les autres en cultivant les cellules en présence de l'antibiotique spécifique du gène de résistance aux médicaments des plasmides.

B. 1b. Vecteurs de bactériophages :

Il existe différentes classes de vecteurs bactériophages, selon que l'ADN chromosomique à l'intérieur du bactériophage est simple brin ou double brin et la taille de l'insert d'ADN du donneur.

B. 1c. Bactériophage (Lambda) :

Il est utilisé comme vecteur de clonage pour les inserts d'ADN double brin jusqu'à environ 25 kb. Les têtes de phage lambda abritent un ADN linéaire (génome) d'environ 50 kb de long. La partie centrale du génome n'est pas requise pour la réplication ou l'empaquetage et donc une partie centrale peut être découpée en utilisant une enzyme de restriction et jetée.

Les deux bras restants à chaque extrémité du génome sont ligaturés à l'ADN du donneur digéré par restriction (Fig. 21.3). Les molécules recombinantes peuvent être introduites dans E. coli par transformation. Une fois dans la bactérie, l'insert d'ADN du donneur est amplifié avec l'ADN lambda/phage et conditionné dans une nouvelle génération de particules virales, qui sont libérées lorsque la cellule est lysée. Les particules libérées infectent de nouvelles cellules. Cela se traduit par l'apparition d'une tache claire (ou plaque) dans la plaque bactérienne au site de l'infection. Chaque plaque abrite des millions de grosses particules, chacune portant une seule copie du même insert d'ADN de donneur.

B. 1d. Vecteurs pour les inserts d'ADN plus grands :

La taille maximale de l'ADN donneur qui peut être inséré dans un plasmide ou vecteur standard est d'environ 30 kb de longueur. Pour répondre à ces demandes, plusieurs vecteurs ont été conçus. Les plus gros inserts procaryotes utilisent le système vecteur BAC (bacterial artificial chromosome). Il est basé sur le plasmide F de 7 kb et a la capacité d'accepter des inserts d'ADN plus grands (jusqu'à environ 300 kb).

Pour les inserts de plus de 300 kb, YAC (yeast artificial chromosome) - un système de vecteur eucaryote basé sur des chromosomes de levure introduits dans des cellules de levure par transformation, est utilisé pour cloner des molécules recombinantes d'une longueur pouvant atteindre 1 000 kb.

B. 1e. Constitution d'une bibliothèque d'ADN :

Le clonage d'ADN est fréquemment utilisé pour produire des bibliothèques d'ADN, qui sont des collections de fragments d'ADN clonés. Il existe deux types fondamentaux de bibliothèques d'ADN : les bibliothèques génomiques et les bibliothèques d'ADNc. Les bibliothèques génomiques sont produites à partir d'ADN total obtenu à partir de noyaux et contiennent toutes les séquences d'ADN de l'espèce.

Une fois qu'une bibliothèque génomique d'une espèce est créée, les scientifiques peuvent utiliser la bibliothèque pour isoler des segments d'ADN spécifiques. Les bibliothèques d'ADNc sont dérivées de copies d'ADN de la population d'ARNm. Les bibliothèques d'ADNc sont produites à partir d'ARNm présent dans un type cellulaire particulier et cela correspond aux gènes actifs dans ce type de cellule.

B. 1f. Identification des molécules d'ADN d'intérêt :

Immédiatement après le clonage, la tâche suivante consiste à trouver ce clone particulier qui contient le gène souhaité. Cela a été fait soit en utilisant des sondes spécifiques (pour trouver de l'ADN ou une protéine) soit en sondant un acide nucléique spécifique.

B. 1g. Utilisation de la technologie de l'ADN recombinant pour le génie génétique :

L'utilisation de techniques sophistiquées d'ADN recombinant pour modifier le génotype et le phénotype d'un organisme est appelée génie génétique. Cela se fait en introduisant des gènes dans des cellules eucaryotes, où ils sont transcrits et traduits. Il existe plusieurs stratégies pour y parvenir. La technique la plus fréquemment utilisée est le transfert de gènes à médiation virale, appelé transduction.

Ici, l'ADN modifié est incorporé dans le génome d'un virus qui ne se réplique pas et permet au virus d'infecter la cellule. C'est le type de virus qui déterminerait si le gène d'intérêt peut être exprimé temporairement ou intégré dans le génome des cellules hôtes. Les rétrovirus ont été utilisés en thérapie génique pour transférer un gène normal dans les cellules d'un patient ayant un gène défectueux. La transfection est un processus par lequel de l'ADN nu peut être introduit dans des cellules en culture.

Au cours du processus, les cellules sont traitées avec du phosphate de calcium ou du DEAE-dextrane, qui forment tous deux un complexe avec l'ADN ajouté qui favorise son adhérence à la cellule. On observe que seules quelques cellules captent l'ADN et l'intègrent de manière stable dans les chromosomes pour former un eucaryote transgénique (Fig. 21.4). Electroporation et lipofection - les deux autres méthodes ont également été utilisées pour transfecter des cellules.

Dans la lipofection, l'ADN étranger se lie à des lipides chargés positivement (liposomes) qui sont capables de fusionner avec la bicouche lipidique de la membrane cellulaire et de fournir l'ADN au cytoplasme. Lors de l'électroporation, l'ADN étranger se fraie un chemin à travers la membrane plasmique modifiée, induite par le courant électrique, dans le noyau et s'intègre dans le génome. L'ADN étranger peut également être introduit dans une cellule par micro-injection directement dans le noyau de la cellule.

Pendant longtemps, les ovocytes de Xenopus ont été utilisés pour étudier l'expression de gènes étrangers. Il contient tous les ingrédients nécessaires à la synthèse de l'ARNm. Lorsque l'ADN étranger est délivré dans le noyau, il initie la transcription et finalement l'ARNm est transporté vers le cytoplasme, où il est traduit en protéines qui peuvent être détectées immunologiquement.

Une autre cible importante pour l'ADN injecté est le noyau d'un embryon de souris. Ici, l'ADN étranger s'intègre dans le chromosome de l'œuf, qui passera à toutes les cellules de l'embryon et enfin à l'adulte. Les animaux qui ont été génétiquement modifiés sont appelés animaux transgéniques.

Le premier animal transgénique a été créé par Ralph Brinster de l'Université de Pennsylvanie et Richar Palmiter de l'Université de Washington en 1981. Ils ont réussi à introduire un gène de l'hormone de croissance du rat (GH) dans les œufs fécondés de souris. L'ADN injecté a été construit de telle sorte que le gène de la GH de rat (protéine codante) soit situé en aval de la région promotrice du gène de la métallothionéine de souris.

Chez un rat normal, la synthèse du gène de la métallothionéine est accélérée suite aux traitements de métaux comme le cadmium, le zinc ou les hormones glucocorticoïdes. Chez les souris transgéniques, la synthèse du gène GH s'est améliorée après un traitement avec des métaux et des glucocorticoïdes. Les souris sont les modèles les plus importants pour la génétique des mammifères. La technologie développée chez la souris est applicable à l'homme.

Il existe deux stratégies de transgénèse chez la souris : l'insertion ectopique et le ciblage génique. La procédure impliquée dans l'insertion ectopique consiste simplement à injecter des solutions d'ADN cloné par voie bactérienne dans le noyau d'embryons à un stade précoce, ce qui a été discuté précédemment. Le ciblage génique est un événement un peu rare et un processus en plusieurs étapes est nécessaire impliquant l'utilisation de cellules souches embryonnaires. Les cellules souches embryonnaires (ES) ont la capacité de former toutes les parties d'une souris, c'est pourquoi elles sont appelées cellules totipotentes.

Le processus de ciblage génique peut être reconnu par l'un de ses résultats, la substitution d'un gène non fonctionnel au gène normal. Ce type d'inactivation ciblée s'appelle un knock-out de gène. Ici, les cellules souches embryonnaires sont isolées d'une souche de souris (albinos) et les embryons sont transfectés avec un insert d'ADN contenant un allèle mutant inactif du gène à éliminer.

Les cellules ES sont ensuite injectées dans l'embryon de jeune souris receveuse (blastocèle) collecté à partir d'une souche albinos. Dans l'étape suivante, l'embryon contenant les cellules ES se développe jusqu'à terme en mère porteuse. La descendance résultante est chimérique, ayant un tissu dérivé à la fois des souches donneuses (ES transplantées) et receveuses. Des souris chimériques sont ensuite accouplées avec leur frère pour produire des souris homozygotes avec le knock-out dans chaque copie du gène (Fig. 21.5). Ce sont des souris knock-out qui n'ont pas de copie fonctionnelle du gène.

Le terme « clonage » fait généralement référence à trois procédures différentes. Les trois types de clonage sont : le clonage d'embryons, le clonage d'ADN adulte et le clonage thérapeutique.

B. 2. Clonage d'embryons :

Il pourrait être plus précisément appelé « jumelage artificiel » car il stimule le mécanisme par lequel les jumeaux se développent naturellement. Cela implique de retirer une ou plusieurs cellules d'un embryon et d'encourager une cellule à se développer en un embryon séparé avec le même ADN que l'original.

Il a été réalisé avec succès pendant des années sur de nombreuses espèces d'animaux, notamment les bovins, les moutons, les porcs, les chèvres, les chevaux, les taupes, les chats, les rats et les souris. La technologie du clonage d'embryons a été réalisée de deux manières : le transfert nucléaire et la cellule souche embryonnaire. Le clonage d'embryons est utilisé chez la souris depuis la fin des années 1970 et l'élevage d'animaux depuis les années 1980.

B. 2a. Transfert nucléaire :

La technique consiste à cultiver des cellules somatiques à partir d'un tissu approprié (de préférence des fibroblastes) des animaux à cloner. Les noyaux des cellules somatiques cultivées sont ensuite micro-injectés dans un ovocyte énucléé obtenu à partir d'un autre individu de la même espèce ou d'espèces étroitement apparentées.

Par un processus qui n'est pas encore compris, le noyau des cellules somatiques est reprogrammé selon un modèle d'expression génique approprié pour diriger le développement normal de l'embryon. Après une nouvelle culture et un développement in vitro, les embryons sont transférés à une femelle receveuse et, en fin de compte, aboutiraient à la naissance d'une progéniture vivante.

Le taux de réussite de la production d'animaux par transfert nucléaire est inférieur à 10 % et dépend de nombreux facteurs, notamment l'espèce impliquée, la source des ovules receveurs, le type de cellule des noyaux donneurs, le traitement des cellules donneuses avant le transfert des noyaux et les techniques utilisées pour le transfert nucléaire.

Le premier clonage humain annoncé publiquement a été réalisé par Robert J. Stillman et son équipe du George Washington Medical Center à Washington D.C. Ils ont prélevé 17 embryons humains génétiquement défectueux. Ces embryons provenaient d'ovules fécondés par deux spermatozoïdes. Cela a abouti à un ensemble supplémentaire de chromosomes qui a ruiné le destin de l'ovule. Aucun n'aurait pu devenir un fœtus. Ces ovules ont été séparés avec succès en 1994, chacun produisant un ou plusieurs clones.

B. 3. Clonage d'ADN adulte (clonage reproductif) :

Cette technique est utilisée pour produire un duplicata d'un animal existant. Il a été utilisé pour cloner un mouton et d'autres mammifères. Le clonage reproductif était auparavant considéré comme impossible chez tous les mammifères jusqu'à ce qu'il soit activé en 1996 par un scientifique, le Dr Ian Wialmut du Roslin Institute de Roslin, en Écosse, au Royaume-Uni. aux médias le 23 février 1997. Elle est le premier grand animal cloné utilisant l'ADN d'un autre adulte.

Une cellule a été prélevée dans le tissu mammaire d'une brebis mature de six ans alors que son ADN était en état de dormance. Il a été fusionné avec un ovule de mouton dont le noyau a été retiré. La cellule «fertilisée» a ensuite été stimulée par une impulsion électrique. Sur 277 tentatives de fusion cellulaire, seulement 29 ont commencé à se diviser. Ceux-ci ont tous été implantés dans des brebis, 13 sont tombées enceintes mais un seul agneau, Dolly, est né. Le 4 mars 1997, le président Clinton a ordonné une interdiction généralisée du financement fédéral du clonage humain aux États-Unis. Les recherches sur le clonage humain se poursuivent dans d'autres pays.

Au cours des 25 dernières années, des progrès considérables ont été réalisés dans l'analyse des génomes eucaryotes. Ce progrès a commencé lorsque les biologistes moléculaires ont appris à construire des molécules d'ADN recombinant, qui sont des molécules contenant des séquences d'ADN dérivées de plusieurs sources.

Elle implique l'isolement du génome d'un segment particulier d'ADN qui code pour un polypeptide particulier, l'isolement d'enzymes qui couperaient l'ADN à des emplacements précisément définis (endonucléases de restriction) et celles qui rejoindraient de manière covalente des fragments d'ADN (ligases).

Les principales étapes du clonage d'ADN sont indiquées dans (Fig. 21.6) et impliquent les procédures suivantes :

1. Isolement de l'ADN à cloner.

2. Insertion de l'ADN isolé dans un autre morceau d'ADN appelé vecteur, qui est un véhicule pour transporter l'ADN étranger dans une cellule hôte appropriée telle que la bactérie E. coli. Bien que (Fig. 21.2). montre l'utilisation d'un vecteur plasmidique, d'autres types de vecteurs, peuvent également être utilisés comme le Bactériophage lambda.

3. Transfert des vecteurs recombinants dans des cellules bactériennes soit par transformations par infection à l'aide de virus.

4. Sélection des cellules qui contiennent les vecteurs recombinants souhaités.

5. Croissance des bactéries pour donner autant d'ADN cloné que nécessaire.

B. 3a. Isolement de l'ADN à cloner :

L'organisme à l'étude, qui sera utilisé pour donner de l'ADN pour l'analyse, est appelé organisme donneur. Trois sources de segment d'ADN peuvent être considérées : l'ADN génomique, l'ADN complémentaire et l'ADN synthétisé chimiquement.

Ces séquences d'ADN existent dans les chromosomes de l'organisme à l'étude et sont donc la source d'ADN la plus facile.

ADN complémentaire (ADNc) :

L'ADN complémentaire ou ADNc, est essentiellement une version d'ADN double brin d'une molécule d'ARNm. L'ADNc est fabriqué à partir d'ARNm à l'aide d'une enzyme spéciale appelée transcriptase inverse, isolée à l'origine des rétrovirus. Avec l'utilisation d'une molécule d'ARNm comme matrice, la transcriptase inverse synthétise une molécule d'ADN simple brin qui peut être utilisée comme matrice pour la synthèse d'ADN double brin. La synthèse de l'ADNc est très importante dans l'analyse de la structure et de l'expression des gènes (Fig. 21.6).

ADN synthétisé chimiquement :

Des techniques de synthèse chimique d'oligonucléotides ont été développées pour produire une séquence d'ADN à des fins d'ADN recombinant.

B. 3b. Construction de l'ADN recombinant :

Les molécules d'ADN isolées sont brisées en petits fragments en les digérant par voie enzymatique avec des endonucléases (enzymes de restriction) qui clivent à des sites spécifiques. Les enzymes de restriction coupent au niveau de séquences cibles d'ADN spécifiques (impliquant 4 à 8 nucléotides) et cette propriété est l'une des caractéristiques clés qui les rendent adaptées à la manipulation de l'ADN.

C'est purement, par hasard, que toute molécule d'ADN, qu'elle soit dérivée de virus, de bactéries, de plantes et d'animaux, contient des sites cibles d'enzymes de restriction. Ainsi, en présence d'une enzyme de restriction appropriée, l'ADN serait coupé en un ensemble de petits fragments selon l'emplacement des sites de restriction.

L'enzyme de restriction EcoR1 (d'E. coli) reconnaît la séquence de 6 paires de nucléotides suivante dans l'ADN de tout organisme :

Ce type de segment est appelé palindrome d'ADN, ce qui signifie que les deux brins ont la même séquence nucléotidique mais dans une orientation antiparallèle. EcoR1 reconnaît et coupe uniquement dans la séquence palindrome GAATTC.

Les coupures sont entre les nucléotides G et A sur chaque brin du palindrome :

Ces coupes décalées laissent une paire d'extrémités collantes longues et simples à cinq bases identiques ‘. Les extrémités sont appelées collantes car, étant monocaténaires, elles peuvent être hybridées par liaison hydrogène de paires de bases à une copie complémentaire. La production de ces extrémités cohésives est une autre caractéristique de nombreuses enzymes de restriction qui en font des outils appropriés pour la technologie de l'ADN recombinant.

Si deux molécules d'ADN sont coupées avec la même enzyme de restriction productrice d'extrémités collantes, les fragments de chacune auront les mêmes extrémités collantes complémentaires, leur permettant de s'hybrider entre elles dans les conditions appropriées dans un tube à essai. (Fig. 21.7). illustre l'enzyme de restriction effectuant une coupe unique dans la molécule d'ADN circulaire telle qu'un plasmide (vecteur), la coupe ouvre le cercle et la molécule de revêtement résultante a deux extrémités collantes.

Si une telle molécule est mélangée avec une molécule d'ADN différente (fragment d'ADN donneur contenant de l'insuline - gène coupé avec EcoR1, comme indiqué dans (Fig. 21.7)), les deux peuvent alors s'hybrider l'une à l'autre par des extrémités cohésives complémentaires pour former une molécule recombinante. Il y a deux raisons pour lesquelles l'ADN du donneur contenant le gène de l'insuline doit être attaché à des segments d'ADN plasmidique pour former des molécules recombinantes utiles.

Premièrement, un segment d'ADN de donneur fragmenté n'a pas à lui seul les séquences d'ADN nécessaires pour lui permettre d'être répliqué dans un tube à essai ou à l'intérieur d'un organisme hôte. L'ADN du donneur doit être physiquement attaché à d'autres segments d'ADN qui peuvent supporter la réplication dans un tube à essai ou à l'intérieur d'une cellule hôte. Deuxièmement, une expérience peut exiger que plusieurs fragments soient collés ensemble pour former une unité fonctionnelle (par exemple un gène transcriptionnellement actif).

Le plus souvent, l'ADN donneur et l'ADN plasmidique sont digérés ensemble en présence d'ADN ligase. Au cours de l'incubation, deux types d'ADN deviennent liés l'un à l'autre par leurs extrémités collantes, puis ligaturés pour former des recombinants d'ADN circulaires.

B. 4. Clonage thérapeutique :

Il s'agit d'une procédure dont les étapes initiales sont identiques au clonage d'ADN adulte. Cependant, les cellules souches sont retirées du pré-embryon avec l'intérêt de produire du tissu ou un organe entier pour une transplantation chez la personne qui a fourni l'ADN. Le pré-embryon meurt dans le processus. L'objectif du clonage thérapeutique est de produire une copie de santé d'un tissu ou d'un organe d'une personne malade en vue d'une transplantation.

Le tissu ou l'organe aurait l'ADN original de la personne malade et, par conséquent, le patient n'a pas besoin de prendre des médicaments immunosuppresseurs pour le reste de sa vie. Les scientifiques tentent de créer des porcs transgéniques qui ont des gènes humains. Leur cœur, leur foie ou leurs reins pourraient être utilisés comme greffes d'organes chez l'homme. Cela sauvera de nombreuses vies car des milliers de personnes meurent chaque année en attendant des organes humains.

Une fois atteint, les animaux transgéniques pourraient être clonés pour produire autant d'organes que nécessaire. Les chercheurs ont produit des animaux transgéniques généralement afin de produire des hormones ou des protéines humaines dans son lait. Ces substances peuvent être séparées du lait et être utilisées pour le traitement de maladies humaines.

La thérapie génique est une technique de correction des gènes responsables du développement de la maladie. La promesse de la thérapie génique était évidente dès les premiers essais initiés en 1989. La maladie abordée était le déficit en adénosine désaminase (ADA), une maladie autosomique récessive rare dans laquelle le manque d'une enzyme domestique dans le corps est nocif pour le système immunitaire.

Là, l'absence d'ADA entraîne la mort prématurée des lymphocytes T, conduisant à un état d'immunodéficience (SCID – sévère immunodéficience combinée). Au National Institute of Health, des chercheurs américains ont transféré un gène ADA normal dans les lymphocytes d'enfants nés avec la maladie.

Dans des essais ultérieurs, le gène a été placé dans des cellules de moelle osseuse. Dans les deux stratégies, la manipulation était ex vivo. La patiente a reçu une injection de ses propres cellules sanguines transfectées avec un gène ADA de type sauvage. Parallèlement, elle a reçu de l'adénosine désaminase obtenue à partir de sang de bétail. Bien que les avantages cliniques à long terme n'aient pas encore été appréciés, ces premiers efforts ont servi à établir le potentiel de la délivrance de gènes en tant que stratégie thérapeutique (Fig. 21.8).

Les chercheurs utilisent l'une des nombreuses approches pour corriger les gènes défectueux :

une. Un gène normal peut être inséré dans un emplacement non spécifique dans le génome pour remplacer un gène non fonctionnel. Cette approche est la plus couramment pratiquée.

b. Un gène anormal pourrait être échangé contre un gène normal par recombinaison homologue.

c. Le gène anormal pourrait être réparé par mutation inverse sélective, qui ramène le gène à sa fonction normale.

ré. La régulation (le degré auquel un gène est activé ou désactivé) d'un gène particulier pourrait être modifiée.

Dans la plupart des études de thérapie génique, un gène « normal » est inséré dans le génome pour remplacer un gène pathogène « anormal ». Un vecteur doit être utilisé pour délivrer le gène thérapeutique aux cellules cibles du patient. Actuellement, le vecteur le plus courant est un virus qui a été génétiquement modifié pour porter de l'ADN humain normal. Les virus ont développé un moyen d'encapsuler et de livrer leur gène aux cellules humaines d'une manière pathogène. Les scientifiques ont essayé de tirer parti de cette capacité et de manipuler le génome du virus pour éliminer les gènes pathogènes et insérer des gènes thérapeutiques.

Les cellules cibles telles que les cellules hépatiques ou pulmonaires du patient sont infectées par le vecteur viral. Le vecteur décharge ensuite son matériel génétique contenant le gène humain thérapeutique dans
la cellule cible. La génération d'un produit protéique fonctionnel à partir du gène thérapeutique restaure la cellule cible à un état normal.

Il existe un certain nombre de vecteurs de thérapie génique. Certains des vecteurs sont :

Une classe de virus qui peuvent créer des copies d'ADN double brin de leur génome d'ARN. Ces copies de son génome peuvent être intégrées dans les chromosomes des cellules hôtes. Le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) est un rétrovirus.

Une classe de virus avec un génome à ADN double brin qui provoque des infections respiratoires, intestinales et oculaires chez l'homme. Le virus qui cause le rhume est un adénovirus.

Virus adéno-associés :

Une classe de petits virus à ADN simple brin qui peuvent insérer leur matériel génétique à un site spécifique sur le chromosome 19.

Virus de l'herpès simplex :

Une classe de virus à ADN double brin qui infectent un type cellulaire particulier, les neurones, le type de virus Herpes simplex est un agent pathogène humain commun qui provoque des boutons de fièvre.

Un gène reçoit un support plus ou moins artificiel dans certains cas, une encapsulation lipidique, afin de faciliter le passage à travers la membrane cellulaire dans d'autres, une minuscule perle d'or sur laquelle le gène est plaqué afin qu'il puisse être injecté dans la peau dans d'autres encore , une protéine à laquelle le gène est attaché.

Exigences de la thérapie génique:

Le gène (par exemple le gène ADA) est identifié et cloné. Il est ensuite inséré dans les propres cellules du patient (ex vivo), en les traitant en culture tissulaire et en les restituant au patient. Il doit être inséré dans l'ADN, transcrit et traduit avec une efficacité suffisante pour qu'une quantité intéressante de l'enzyme soit produite.

Les rétrovirus sont utilisés comme vecteur de gène. Les rétrovirus ont plusieurs avantages pour introduire des gènes dans les cellules humaines - leur protéine d'enveloppe permet au virus d'infecter les cellules humaines. Des copies d'ARN du gène ADA humain peuvent être incorporées dans le génome rétroviral en utilisant une cellule d'encapsidation.

Les cellules d'encapsidation expriment (i) une copie d'ARN du gène ADA humain ainsi qu'un signal d'encapsidation (P) nécessaire à l'assemblage de particules virales fraîches et de répétitions inversées (R) à chaque extrémité pour faciliter l'insertion des copies d'ADN dans l'ADN de les cellules cibles,

(ii) une copie d'ARN des gènes rétroviraux gag, pol et env mais sans signal d'encapsidation de sorte que les gènes ne peuvent pas être incorporés dans des particules virales fraîches.

Traitée avec ces deux génomes, la cellule d'empaquetage produit une récolte de rétrovirus avec :

(i) La protéine d'enveloppe nécessaire pour infecter la cellule cible humaine,

(ii) Une copie d'ARN du gène ADA humain, avec des séquences R à chaque extrémité

(iii) la transcriptase inverse nécessaire pour faire une copie du gène ADA pouvant être insérée dans l'ADN de la cellule cible,

(iv) Aucun des gènes (gag, pol, env) qui permettraient au virus de se répliquer dans son nouvel hôte. Une fois que le virus a infecté les cellules cibles, cet ARN est inversement transcrit en ADN et inséré dans l'ADN chromosomique de l'hôte.

En outre, il existe plusieurs autres options pour la livraison de gènes. La méthode la plus simple est l'introduction directe d'ADN thérapeutique dans des cellules cibles. Cette approche est limitée dans son application car elle ne peut être utilisée qu'avec certains tissus et nécessite une grande quantité d'ADN.

État actuel de la recherche en thérapie génique :

La Food and DRUG Administration (FDA) n'a pas encore approuvé la vente de thérapie génique humaine. La thérapie génique actuelle est expérimentale et ne s'est pas avérée très efficace dans les essais cliniques. Peu de progrès ont été réalisés depuis le début du premier essai clinique de thérapie génique en 1990.

En 1999, la thérapie génique a subi un revers majeur avec la mort de Jesse Gelsinger, 18 ans. Jesse participait à un essai de thérapie génique pour le déficit en ornithine transcarboxylase (OTCD). Il est décédé de défaillances d'organes multiples 4 jours après le début du traitement. On pense que sa mort a été déclenchée par une réponse immunitaire sévère à l'adénovirus.

Un autre coup dur est survenu en janvier 2003, lorsque la FDA a temporairement suspendu tous les essais de thérapie génique utilisant des vecteurs rétroviraux dans les cellules souches du sang. La FDA a pris cette mesure après avoir appris qu'un deuxième enfant traité dans un essai de thérapie génique français avait développé une maladie semblable à la leucémie. L'enfant et un autre, qui avaient développé une maladie similaire en août 2002, avaient été traités avec succès par thérapie génique pour le syndrome d'immunodéficience combinée sévère lié à l'X (X-SCID), également connu sous le nom de « syndrome du bébé à bulles ».

Le comité consultatif sur les modificateurs de réponse biologique (BRMAC) de la FDA s'est réuni fin février 2003 pour discuter des mesures possibles qui pourraient permettre à un certain nombre d'essais de thérapie génique rétrovirale pour le traitement de maladies potentiellement mortelles de procéder avec des garanties appropriées. La FDA n'a pas encore pris de décision sur la base des discussions et des conseils de la réunion du BRMAC.

B. 4b. Problèmes avec la thérapie génique :

Nature de courte durée de la thérapie génique : avant que la thérapie génique ne devienne un remède permanent pour n'importe quelle affection, l'ADN thérapeutique introduit dans les cellules cibles doit rester fonctionnel et les cellules contenant l'ADN thérapeutique doivent avoir une longue durée de vie et être stables. Les problèmes d'intégration de l'ADN thérapeutique dans le génome et la nature à division rapide de nombreuses cellules empêchent la thérapie génique d'obtenir des avantages à long terme. Les patients devront subir plusieurs cycles de thérapie génique.

Chaque fois qu'un corps étranger est introduit dans les tissus humains, le système immunitaire est désigné pour attaquer l'envahisseur. Le risque de stimuler le système immunitaire d'une manière qui réduit l'efficacité de la thérapie génique est toujours un risque potentiel. De plus, la réponse immunitaire accrue aux envahisseurs rend difficile la répétition de la thérapie génique chez les patients.

Problèmes avec les vecteurs viraux :

Les virus, le vecteur de choix dans la plupart des études de thérapie génique, présentent une variété de problèmes potentiels pour le patient tels que la toxicité, les réponses immunitaires et inflammatoires. De plus, on craint toujours que le vecteur viral, une fois à l'intérieur du patient, ne retrouve sa capacité à provoquer la maladie.

Les affections ou troubles résultant de mutations dans un seul gène sont les meilleurs candidats à la thérapie génique. Malheureusement, certains des troubles les plus courants tels que les maladies cardiaques, l'hypertension artérielle, la maladie d'Alzheimer, l'arthrite et le diabète sont causés par les effets combinés de variations dans de nombreux gènes. Des troubles multigéniques ou multifactoriels tels que ceux-ci seraient particulièrement difficiles à traiter efficacement en utilisant la thérapie génique.

C. Incertitudes liées à la biotechnologie animale :

Comme pour les nouvelles technologies, la biotechnologie animale est confrontée à une variété d'incertitudes, de problèmes de sécurité et de risques potentiels. Par exemple, des préoccupations ont été soulevées concernant : l'utilisation de gènes inutiles dans des constructions utilisées pour générer des animaux transgéniques, l'utilisation de vecteurs susceptibles d'être transférés ou de contribuer d'une autre manière à des séquences d'autres organismes, les effets potentiels d'animaux génétiquement modifiés sur la l'environnement, les effets de la biotechnologie sur le bien-être de l'animal et les problèmes potentiels de santé humaine et de sécurité sanitaire des aliments pour la viande ou les produits animaux dérivés de la biotechnologie animale. Avant que la biotechnologie animale ne soit largement utilisée par les systèmes de production de l'agriculture animale, des recherches supplémentaires seront nécessaires pour déterminer si les avantages de la biotechnologie animale l'emportent sur ces risques potentiels.


Technique PCR : étape par étape

7. L'échelle d'ADN "se décompresse" en deux brins séparés

L'ADN polymérase et un mélange des quatre nucléotides sont ajoutés à un tube à essai contenant l'échantillon d'ADN extrait. Lorsque l'ADN parental double brin (modèle) est chauffé à 95 degrés Celsius, les brins individuels se déroulent et se séparent les uns des autres. L'objectif est de répliquer la section de chaque brin contenant le gène cible en utilisant l'enzyme ADN polymérase. Chaque brin parental unique d'ADN a la propriété remarquable de reconstruire le brin complémentaire manquant lorsque les nucléotides se fixent dans le sens 5 prime (5') à 3 prime (3'). Chaque brin complémentaire nouvellement formé (un pour chaque brin parental) est appelé « brin fille ».

Lorsque la molécule d'ADN parentale double brin (échelle d'ADN) est chauffée à 95 °C, les deux brins individuels se séparent. L'ADN polymérase facilite la fixation des nucléotides complémentaires pour reconstruire chaque brin, ce qui donne deux molécules double brin. P = phosphate, D = désoxyribose, A = adénine, T = thymine, G = guanine et C = cytosine. La "queue" étendue de phosphate représente la position 5' de chaque brin.

Lorsque la molécule d'ADN parentale double brin (échelle d'ADN) est chauffée à 95 °C, les deux brins individuels se séparent. L'ADN polymérase facilite la fixation des nucléotides complémentaires pour reconstruire chaque brin, ce qui donne deux molécules double brin. La section rose représente le gène cible réel qui sera répliqué.

8. L'amorce se fixe à une extrémité du brin d'ADN

Pour que l'ADN polymérase trouve le début d'un gène cible spécifique dans chaque section d'ADN, un court segment d'ADN appelé amorce doit être attaché (hybridé) à chaque brin d'ADN "mère" en amont (vers l'extrémité 3') de chaque gène. L'amorce ne chevauche pas le gène cible, car elle est complémentaire de la séquence de bases qui apparaît juste avant le gène sur le brin mère d'ADN. Le brin "fille" complémentaire est réalisé dans le sens 5' vers 3'. Les amorces contiennent environ 20 bases et elles ont été synthétisées pour de nombreux gènes couramment amplifiés à l'aide de la technique PCR. Ils peuvent être achetés auprès de sociétés d'approvisionnement en biotechnologie. L'amorce d'un gène spécifique est ajoutée au mélange d'ADN simple brin après refroidissement à 52-54 o C (126-129 o F).

De courtes sections (oligonucléotides) appelées amorces se fixent en amont de chaque gène (vers l'extrémité 3' du brin parental "mère"). Maintenant, l'ADN polymérase peut reconnaître le début du gène et reconstruire le brin complémentaire dans la direction 5' à 3'.

Au fur et à mesure que l'échelle d'ADN parentale double brin (modèle) se décompresse et que les nucléotides s'attachent à chacun des deux brins parentaux simples, quelque chose de très intéressant se produit. Un brin fille, appelé « brin principal », se forme en continu lorsque les nucléotides se fixent dans la direction 5' à 3'. Mais dans l'autre brin fille, appelé « brin retardé », les nucléotides se fixent en sections discontinues. Ces sections sont appelées fragments d'Okazaki, du nom du scientifique japonais Reiji Okazaki qui les a découvertes. Etant donné que le brin retardé est complémentaire du brin avant, son extrémité 3' est opposée à l'extrémité 5' du brin avant, et vice versa. La seule façon dont ce brin peut s'allonger dans la direction 5' à 3' lorsque la molécule d'ADN parentale se décompresse est de se développer en sections ou en fragments. Cette découverte remarquable est illustrée dans l'illustration suivante.

Lorsque les brins d'ADN parentaux (modèles) se répliquent, les brins filles sont synthétisés de deux manières différentes. Le brin principal est formé en continu lorsque des nucléotides simples se fixent un par un dans une direction 5' à 3'. Le brin retardé est formé de manière discontinue lorsque des sections préformées de nucléotides (appelées fragments d'Okazaki) s'attachent dans une direction 5' à 3'.

9. Télomères : une solution moléculaire majeure au problème de réplication finale

L a structure et la fonction de l'ADN sont certainement deux des découvertes les plus importantes qui ont révolutionné la science de la biologie. Même si l'ADN semble être une molécule de stockage parfaite pour l'information génétique, il a un sérieux problème de réplication. Les chromosomes des cellules eucaryotes sont composés d'ADN linéaire. Pour que la division cellulaire ait lieu, la molécule d'ADN doit se répliquer. En d'autres termes, le chromosome unique doit devenir un chromosome doublé composé de deux chromatides. Le problème est que chaque fois que l'ADN se réplique, les nouvelles molécules deviennent légèrement plus courtes. Après plusieurs divisions consécutives, cette dégradation pourrait entraîner une grave perte de gènes aux extrémités des chromosomes. Alexey Olovnikov et James Watson ont tous deux décrit indépendamment ce phénomène appelé « problème de réplication finale » au début des années 1970. En fait, "A Theory of Marginotomy" d'Olovnikov a prédit que la perte de séquences terminales résultant d'un problème de réplication terminale conduirait à la sénescence (Olovnikov, 1973). [James Watson et Francis Crick ont ​​découvert la structure de l'ADN en 1953 et ont reçu le prix Nobel de médecine en 1962.]

Pour faire face au problème de réplication dévastateur, les cellules eucaryotes ont développé des "capuchons" protecteurs aux extrémités des chromosomes appelés télomères. Pour leur découverte de la façon dont les chromosomes sont protégés par les télomères et l'enzyme télomérase, Elizabeth Blackburn, Jack Szostak et Carol Greider ont reçu le prix Nobel de médecine en 2009. Grâce à leurs recherches génétiques ingénieuses et leurs études biochimiques méticuleuses, ils ont non seulement résolu un problème fondamental. en biologie mais a également ouvert un nouveau champ de recherche et initié le développement de thérapies potentielles contre le vieillissement et le cancer. Il faut noter ici que plus de 60 ans plus tôt, Barbara McClintock étudiait les télomères du maïs. Au début des années 40, elle s'est intéressée à l'étude des éléments transposables (transposons) dans le maïs, un autre phénomène génétique remarquable ayant d'importantes implications médicales chez l'homme. Pour ses recherches de toute une vie sur les transposons, elle a reçu le prix Nobel de médecine en 1983.

Les télomères sont des brins répétitifs d'ADN (séquences de bases répétitives) aux extrémités terminales des chromosomes linéaires. Ils jouent un rôle essentiel dans le maintien de l'intégrité du chromosome en le protégeant de la dégradation et de la fusion de bout en bout avec d'autres chromosomes. Les télomères sont essentiellement des « embouts » protecteurs de l'ADN non codant aux extrémités des chromosomes. Les télomères ont été métaphoriquement comparés aux pointes des lacets qui empêchent les lacets de se défaire. Chaque fois qu'une cellule se divise, les télomères perdent une petite quantité d'ADN. Finalement, lorsque tout l'ADN des télomères a disparu, la cellule ne peut plus se diviser et meurt. Le problème de réplication des extrémités n'est pas un problème dans les cellules procaryotes car elles ont des molécules d'ADN circulaires sans extrémités.

Le nombre de fois qu'une population de cellules normales peut se diviser est appelé la limite de Hayflick, du nom de son découvreur Leonard Hayflick. En 1961, Hayflick a démontré que les cellules fœtales humaines normales dans une culture se divisent entre 40 et 60 fois. Il est maintenant clair que la division cellulaire se produit jusqu'à ce que les télomères atteignent une longueur critique. La longueur estimée des télomères humains varie de 8 000 paires de bases à la naissance à 3 000 avec l'âge, et jusqu'à 1 500 chez les personnes âgées. À partir de 8 000 paires de bases, une perte de 100 à 200 à chaque division éroderait complètement les télomères en 40 à 80 divisions.

1. Lorsque l'ADN se décompresse, l'ADN polymérase doit se fixer à l'extrémité 3' du brin mère.
2. Il doit ajouter des nucléotides (synthétiser le brin fille) dans la direction de 5 'à 3'.
3.Une amorce d'ARN doit d'abord se fixer pour donner à l'ADN polymérase un point de départ.

La duplication chromosomique commence par la décompression de l'ADN double brin en deux brins (brin mère #1 & brin mère #2). Ces brins mères complémentaires servent de matrices pour construire deux molécules d'ADN. Une amorce d'ARN se fixe à l'extrémité 3' du brin mère n° 1, donnant ainsi à l'ADN polymérase un point de départ. L'amorce se fixe juste avant la fixation initiale de l'ADN polymérase. L'ADN polymérase se déplace dans la direction 3' à 5' le long du brin mère #1, ajoutant des nucléotides pour former un brin fille complémentaire continu d'ADN sur toute la longueur de la matrice du brin mère #1. Ce brin complémentaire est appelé "brin principal" et il est synthétisé dans le sens 5' vers 3'. [5' et 3' font référence à des atomes de carbone spécifiques du sucre désoxyribose dans les blocs de construction de l'ADN appelés nucléotides.] Lorsque les directions 5' et 3' sont mentionnées, il est important de préciser si vous faites référence au brin mère ou au brin fille complémentaire .

Au fur et à mesure que l'ADN mère d'origine se décompresse, l'ADN polymérase ne peut pas se fixer au sommet du brin mère #2 à la position 5' (en haut à droite dans le diagramme suivant). Même s'il pouvait s'attacher au sommet du brin mère #2 à la position 5', il ne pourrait pas descendre le brin mère et synthétiser un brin fille dans la direction 3' à 5'. Par conséquent, l'ADN polymérase se fixe plus bas sur le brin mère #2 et produit une série de sections d'ADN dans la direction 5' à 3'. Ces sections sont nommées « fragments d'Okazaki » d'après le scientifique japonais Reiji Okazaki qui les a découvertes. Les sections forment collectivement un brin fille appelé « brin retardé » jusqu'au sommet du brin mère #2. Ceci est bien expliqué par R. Ohki, T. Tsurimoto et F. Ishikawa ( Molecular and Cellular Biology Vol. 21, 2001). Les amorces d'ARN courtes doivent se fixer avant chaque section d'ADN afin de former un point de départ pour l'ADN polymérase.

Il y a un problème à l'extrémité 3' du brin mère #2. Lorsque la dernière amorce d'ARN atteint cette extrémité, il n'y a plus de matrice d'ADN pour qu'elle devance l'ADN polymérase. La dernière amorce se fixe à l'extrémité 3', mais l'ADN polymérase ne peut pas ajouter la dernière section du brin retardé, laissant un espace où l'amorce était attachée. Par conséquent, l'extrémité 5' de chaque brin retardé nouvellement synthétisé est raccourcie. Environ 100 paires de bases sont rasées à chaque cycle de réplication, raccourcissant ainsi le télomère. Dans le diagramme suivant, le brin mère n° 2 présente un espace à l'extrémité 5' du brin retardateur nouvellement formé.

Les gifs animés suivants montrent la réplication de l'ADN en six divisions consécutives sans aucun raccourcissement, par rapport au problème de réplication finale sur le brin en retard et au raccourcissement progressif de l'ADN.

Les télomères peuvent être restaurés par l'enzyme télomérase. Cette enzyme allonge les télomères dans les cellules germinales (cellules qui produisent les ovules et le sperme), rétablissant ainsi les télomères à leur longueur maximale dans le zygote. Il est également présent dans d'autres cellules qui doivent se diviser continuellement, notamment les cellules souches de la moelle osseuse qui produisent un grand nombre de générations de globules rouges nécessaires au maintien de la vie, l'épithélium de la peau et les cellules tapissant l'intestin. La télomérase n'est généralement pas active dans les cellules somatiques normales. Cette enzyme ajoute des répétitions de séquence d'ADN non codantes TTAGGG chez les vertébrés à l'extrémité 3' des brins d'ADN dans la région des télomères des chromosomes eucaryotes. La présence de télomérase active dans les cellules cancéreuses peut être utile dans le diagnostic et le traitement de certains cancers avec des inhibiteurs de la télomérase.

L e paragraphe suivant provient de Science and Technology (9 novembre 2007) : Les requins ont de la télomérase dans toutes leurs cellules. Leurs télomères ne raccourcissent pas et les requins n'ont pas une durée de vie génétiquement programmée comme les humains. En fait, les requins continuent de grandir tout au long de leur vie. La limite de leur durée de vie est le fait qu'ils doivent continuer à se déplacer afin de faire circuler l'air à travers leurs branchies pour l'absorption d'oxygène. Les requins sont exceptionnellement stables génétiquement, ayant très peu changé depuis des centaines de millions d'années. De plus, les requins ont rarement le cancer.

Les télomères et la télomérase sont également présents dans les cellules végétales. La biologie des télomères des plantes est résumée par T.D. McKnight et D.E. Shippen dans The Plant Cell Vol. 16 : 794-803 (2004). Dans la plupart des plantes à fleurs, les télomères sont constitués des répétitions de base d'ADN TTTAGGG. Comme les cellules somatiques des animaux, il y a peu ou pas de télomérase active dans le tissu végétatif, bien qu'elle soit réactivée pendant la floraison, probablement pour faire en sorte que les gamètes et les embryons héritent des télomères restaurés à leur longueur maximale. Comme les cellules cancéreuses chez les animaux, la télomérase est pleinement fonctionnelle dans les cellules des cultures de tissus végétaux, comme on pourrait s'y attendre pour les cellules ayant une capacité illimitée de prolifération. L'ordre des monocotylédones Asparagales qui contient environ 27 000 espèces (environ 10 pour cent de tous les angiospermes) a des répétitions de 6 bases de TTAGGG, la même séquence trouvée dans les télomères des mammifères. Cet ordre comprend de nombreuses familles de plantes familières, telles que les orchidées, l'iris, l'amaryllis, l'agave, l'oignon et l'asperge. Étant donné que les plantes et les mammifères ont évolué en organismes multicellulaires le long de voies complètement séparées, cela semble être un autre exemple d'évolution parallèle (homoplastie).

Les télomères n'empêchent pas le raccourcissement de l'ADN, ils retardent simplement le processus d'érosion. Le mécanisme de raccourcissement des télomères limite normalement les cellules à un nombre fixe de divisions. Finalement, lorsque tout le télomère a disparu, la cellule ne peut plus se diviser, mettant ainsi fin au cycle cellulaire. La plupart des cancers sont le résultat de cellules « immortelles » qui ont échappé à la mort cellulaire programmée due à l'érosion des télomères. Les chromosomes des cellules malignes ne perdent généralement pas leurs télomères, ce qui entraîne une division cellulaire incontrôlée. Des études animales suggèrent que la longueur des télomères peut être liée au processus de vieillissement au niveau cellulaire et à la durée de vie des animaux. Il existe même des études suggérant que l'exercice régulier et la réduction du stress peuvent aider à minimiser l'érosion des télomères. En fait, une étude publiée dans le numéro du 3 mai 2005 de la revue Circulation de l'American Heart Association a révélé que la prise de poids et l'augmentation de la résistance à l'insuline étaient corrélées à un raccourcissement plus important des télomères au fil du temps.

Il est intéressant de spéculer sur l'origine des télomères. S'il existait une autre version de l'ADN polymérase attachée à l'extrémité 5' du brin mère n° 2 et ajoutant des nucléotides dans la direction 3' à 5', alors théoriquement un brin continu pourrait être synthétisé à l'extrémité de la matrice de brin mère sans l'extrémité problème de réplication. Cette version théorique n'a jamais été trouvée et les télomères sont donc essentiels pour empêcher le raccourcissement progressif de l'ADN et l'érosion des gènes. Pourquoi n'y a-t-il qu'une seule forme d'ADN polymérase qui synthétise des brins filles dans le sens 5' à 3' ? C'est comme demander pourquoi les systèmes vivants n'ont que des acides aminés de forme L (gaucher) et des sucres de forme D (droitier). L'évolution des télomères a-t-elle résolu un problème de réplication inhérent à l'ADN d'origine, ou les télomères étaient-ils présents dans l'ADN d'origine des premières cellules eucaryotes ?

Importance évolutive de la réplication du problème final et des télomères

Lorsque j'ai écrit cette section pour la première fois sur le problème de la réplication finale, j'ai conclu qu'il s'agissait d'un défaut de l'ADN qui raccourcissait littéralement la vie d'une cellule en limitant le nombre de divisions. Les télomères servent d'horloges mitotiques qui prolongent la vie par un certain nombre d'érosions consécutives. Cependant, il y a un autre côté de cette histoire où limiter la durée de vie des organismes pourrait en fait être bénéfique. Dans un environnement en évolution rapide, la survie d'une espèce dépend de la variabilité génétique due aux mutations de l'ADN et de la capacité de transmettre ces gènes aux générations futures. Une espèce avec des temps de génération excessivement longs peut ne pas être en mesure de rivaliser car les mutations adaptatives ne peuvent pas suivre les changements environnementaux. Cependant, des durées de génération plus longues pourraient également ralentir la croissance de la population tant que la fécondité (nombre de descendants par femelle) reste constante. Pour un individu, l'immortalité peut sembler bonne, mais cela peut ne pas être bon pour l'espèce. Cette logique est mentionnée dans Star Trek 2: "The Wrath of Khan" lorsque Spock a déclaré: "Le bien du grand nombre l'emporte sur le bien de quelques-uns, ou de l'un." En fait, cette logique est mentionnée deux mille ans plus tôt dans Jean 11 :49-50. Bien sûr, une mise en garde au profit de la perte de réplication finale est le requin, qui a apparemment une télomérase active dans toutes ses cellules et des longueurs de télomères qui ne diminuent pas de manière significative avec l'âge. Les requins (classe Chondrichthyes) sont un groupe très prospère et ils existent depuis plus de 200 millions d'années. En fait, certaines espèces ont des estimations d'âge de 100 ans ou plus. Sans aucun doute, les changements environnementaux dans l'océan n'ont pas été aussi endémiques que sur terre.

10. Les brins d'ADN simples se répliquent en brins doublés

Le mélange d'ADN est chauffé à 72 o C (162 o F) et l'ADN polymérase reconnaît l'amorce annelée à chaque brin et procède à la synthèse du brin complémentaire tout au long du gène. Les nucléotides se fixent le long du gène à partir de toutes les adénines, thymines, cytosines et guanines déjà présentes dans le mélange. Maintenant, le mélange contient deux copies identiques du gène (deux échelles d'ADN complètes). L'ADN polymérase de la bactérie Thermus aquaticus (appelée TAQ polymérase) est utilisée pour la réaction car elle est immunisée contre les températures élevées. Contrairement à la plupart des enzymes protéiques qui sont détruites à des températures supérieures à 40 o C (104 o F), l'ADN polymérase de Thermus aquaticus peut survivre aux 72 o C de la réaction. En fait, cette bactérie vit normalement dans les sources chaudes et peut survivre à des températures approchant le point d'ébullition de l'eau.

Les bactéries des sources chaudes bouillantes dans le parc national de Yellowstone

Les sources chaudes bouillonnantes du parc national de Yellowstone sont colorées par des colonies de cyanobactéries thermophiles, d'eubactéries et d'archébactéries. Les cyanobactéries de couleur orange se trouvent généralement dans l'eau qui a refroidi en dessous de 73 o C (163 o F). Les chlorophylles vertes de ces bactéries photosynthétiques sont masquées par des pigments caroténoïdes orange. Comme les halobactéries rouge vif des lacs salés, les caroténoïdes protègent les cellules délicates du rayonnement solaire intense, en particulier pendant les mois d'été. Les zones plus chaudes et blanchâtres des étangs contiennent des masses filandreuses d'eubactéries non photosynthétiques. Thermus aquaticus survit à des températures trop élevées pour les bactéries photosynthétiques, jusqu'à 80 o C (176 o F). Thermus aquaticus est hétérotrophe et survit grâce à des quantités infimes de matière organique dans l'eau. La polymérase TAQ utilisée dans l'amplification de l'ADN à l'aide de la réaction en chaîne par polymérase (PCR) a été isolée à l'origine d'une colonie de T. aquaticus collectée dans une source chaude du parc national de Yellowstone.

Une source d'eau chaude bouillante dans le parc national de Yellowstone. La coloration rouge orangé est causée par des colonies denses de cyanobactéries photosynthétiques.

Les rchaebacteries se développent dans l'eau bouillante du parc national de Yellowstone, à des températures de 92 o C (198 o F). Ces bactéries se développent également près des évents de vapeur au fond de l'océan à des températures dépassant 115 o C (239 o F). Des scientifiques du monde entier étudient l'étonnante flore bactérienne du parc national de Yellowstone. C'est l'un des meilleurs endroits au monde pour étudier ces organismes dans leurs habitats naturels protégés. Dans d'autres parties du monde, des sources chaudes similaires ont été détruites pour la production d'énergie géothermique.

Sources chaudes bouillantes dans le parc national de Yellowstone. La coloration rouge orangé est causée par des colonies florissantes de cyanobactéries photosynthétiques. Des masses filandreuses d'eubactéries non photosynthétiques se trouvent dans les zones blanchâtres des eaux plus chaudes.

Une source chaude dans le parc national de Yellowstone avec un pH inférieur à 4,0 soutient l'algue eucaryote Cyanidium caldarum. Cette remarquable algue photosynthétique peut même survivre dans un pH de zéro ! Certaines bactéries acidophiles des sources chaudes utilisent l'oxydation du soufre et du fer pour la synthèse de l'ATP. Les sources chaudes alcalines soutiennent des colonies de bactéries qui utilisent le sulfure d'hydrogène comme source d'énergie.

La vie telle que nous la connaissons peut avoir surgi il y a plus de trois milliards d'années dans un environnement à haute température d'eau bouillante. Les bactéries thermophiles dans les sources chaudes du parc national de Yellowstone pourraient être des populations reliques de la première vie sur terre. En fait, ces bactéries thermophiles pourraient être les ancêtres de toutes les autres formes de vie, y compris les humains !

11. Deux échelles d'ADN "décompressées" en quatre brins séparés

Maintenant, le mélange est à nouveau chauffé à 95 °C et les molécules d'ADN double brin contenant les gènes cibles se séparent en brins simples. Mais maintenant, il existe quatre simples brins provenant de deux gènes double brin. Le mélange est à nouveau refroidi à 52-54 °C et les amorces s'hybrident aux brins aux positions de départ avant chaque gène. L'ADN polymérase catalyse à nouveau la reconstruction de chaque brin simple en quatre gènes double brin complets. La PCR est appelée réaction en chaîne par polymérase car la réaction se produit à plusieurs reprises en cycles, car des copies de gènes en double sont produites de manière exponentielle. Après seulement 40 cycles, il y aurait 1,0995116 X 10 12 ou plus d'un trillion de copies du gène original !

Les deux molécules d'ADN double brin (échelles d'ADN) se séparent en quatre brins. L'ADN polymérase reconstruira le brin complémentaire pour chaque échelle, résultant en quatre molécules d'ADN double brin. Remarque : cette illustration ne montre pas le problème de réplication finale où l'ADN se raccourcit lors de divisions répétitives.

12. Utiliser l'ADN de poux pour dater les premiers vêtements portés par les gens

L'une des utilisations les plus novatrices du séquençage de l'ADN est la détermination du moment où les humains ont commencé à porter des vêtements. Selon Mark Stoneking et ses collègues du Max Planck Institute for Evolutionary Anthropology à Leipzig, en Allemagne, nous avons commencé à porter des vêtements il y a environ 70 000 ans. Cette date est basée sur les gènes des poux suceurs humains. Il est en corrélation avec le moment approximatif où le pou de corps a évolué à partir du pou de tête humain et correspond au moment où l'habitat du pou de corps (vêtements) s'est répandu. C'est également à cette époque que l'Homo sapiens sapiens a commencé à quitter l'Afrique pour s'installer dans les régions plus froides d'Europe.


Pou de tête humain
Les poux suceurs appartiennent à l'ordre des insectes parasites sans ailes Anoplura. Les poux suceurs humains comprennent les poux de corps, les poux de crabe et les poux de tête (Pediculus humanus). Les anopluranes utilisent un ensemble de longs stylets hypodermiques pour percer la peau et prélever le sang. Après avoir ingéré du sang, leur corps gonfle et montre un caillot de sang noir dans leur abdomen. Il existe deux formes de poux suceurs humains, le pou de tête ( P. humanus capitis ) et le pou de corps ( P. humanus humanus ). Le pou de tête infeste les cheveux du cuir chevelu et le pou de corps vit dans les vêtements près de la surface du corps. Les poux humains sont également connus sous le nom de « cooties » et leurs œufs attachés aux poils sont appelés « lentes ». Les poux humains provoquent des démangeaisons locales, mais l'inconfort est mineur par rapport à la misère de la bactérie qu'ils peuvent transmettre appelée Rickettsia prowazeki. Cette minuscule bactérie cause le « Typhus épidémique », une maladie grave qui a dévasté les populations de l'Europe médiévale.

Stoneking et ses collègues Ralf Kittler et Manfred Kayser ont comparé les séquences d'ADN mitochondrial des poux de tête et de corps. Plus la différence de séquences entre les deux formes de poux est grande, plus leur division évolutive est ancienne. Les poux humains d'Afrique sont génétiquement plus diversifiés que les poux d'autres parties du monde, ce qui indique que l'espèce est originaire d'Afrique. Les poux de tête sont plus diversifiés que les poux de corps, ce qui montre qu'ils sont le groupe le plus âgé. En comparant l'ADN mitochondrial des poux de corps aux poux de chimpanzés, l'équipe de Stoneking a pu approcher l'origine des poux de corps il y a environ 70 000 ans. Cette date est bien corrélée avec les preuves croissantes que les humains modernes ont évolué en Afrique et ont migré vers le nord il y a environ 100 000 ans.

Stoneking étudie également les poux du crabe humain (Pthirus pubus) qui habitent généralement les poils pubiens. Les poux du pubis humains sont plus étroitement liés aux poux de gorille qu'aux poux de tête. Étant donné que ce pou suceur n'habite que les endroits poilus du corps, il pourrait faire la lumière sur le moment où les humains ont perdu leurs poils lourds. Les poux de crabe sont généralement transférés d'une personne à l'autre lors de rapports sexuels, bien qu'ils puissent également être récupérés sur du linge, des vêtements et d'autres sources infestés.


INTRODUCTION

Les molécules aromatiques polycycliques sont connues pour s'intercaler dans l'ADN double brin (1, 2). Outre le traitement théorique de telles interactions hôte-invité, les conséquences de l'intercalation de l'ADN par des molécules exogènes ont suscité un intérêt considérable en chimie médicinale, car une formation aussi complexe conduit à une modification significative de la structure de l'ADN et peut entraîner une entrave ou une suppression fonction de l'acide nucléique dans les processus physiologiques (3-10). Parce qu'une telle influence sur le système biologique est une exigence principale pour les médicaments ciblant l'ADN, l'intercalation de petites molécules dans l'ADN peut être appliquée dans des approches thérapeutiques dans lesquelles la suppression de la réplication de l'ADN et de la transcription des gènes est utilisée pour détruire les cellules tumorales ou les tissus infectés. . En conséquence, de nombreuses études ont été réalisées pour mieux comprendre les différents aspects du processus d'association de grandes et petites molécules avec l'ADN afin d'obtenir des intercalateurs hautement sélectifs et efficaces (11).

Les colorants organiques cationiques sont généralement considérés comme des intercalants classiques. Des exemples représentatifs sont les dérivés d'acridine comme la proflavine (1) ou l'orange d'acridine (12), les colorants azine comme le bleu de méthylène (13), les sels de phénanthridinium comme le bromure d'éthidium (14) ou les colorants cyanine comme l'orange thiazole (dont les agrégats peuvent également lier au petit sillon) (15-17). L'association de ces composés avec l'ADN influence généralement leurs propriétés d'absorption et d'émission, de sorte que leur interaction avec l'ADN peut être évaluée qualitativement et quantitativement par des titrages spectrophotométriques et spectrofluorométriques (18). Ces méthodes spectroscopiques simples et directes sont particulièrement avantageuses car les colorants organiques absorbent et émettent à des longueurs d'onde qui n'interfèrent pas avec l'absorption des bases de l'ADN (λmax= 260 nm). Ainsi, les titrages spectrophotométriques et spectrofluorométriques indiquent généralement l'association d'un colorant avec l'ADN. De plus, les isothermes de liaison résultantes peuvent être utilisées pour estimer les constantes de liaison et la taille du site de liaison, c'est à dire. le nombre de sites de liaison occupés. De plus, l'absorption de lumière polarisée circulairement ou linéairement peut être utilisée en spectroscopie de dichroïsme circulaire (CD) et de dichroïsme linéaire (LD) pour mieux connaître l'orientation de la molécule de colorant par rapport à l'ADN et en déduire le mode de liaison (19) .Les mesures de polarisation de fluorescence à l'état d'équilibre ainsi que le transfert d'énergie de fluorescence des bases d'ADN au colorant lié ont été utilisés comme critères fiables supplémentaires pour élucider le mode de liaison (20). En plus des méthodes spectroscopiques, des critères hydrodynamiques et thermodynamiques tels que la viscosité, le coefficient de sédimentation ou la température de fusion de l'ADN peuvent être utilisés pour évaluer le mode de liaison (20).

Il est communément établi qu'une charge positive augmente la propension d'une molécule à se lier à l'ADN en raison d'interactions ioniques attractives entre le cation et le squelette phosphate (21). Dans la plupart des colorants cationiques, cette charge positive est établie par une fonctionnalité ammonium exocyclique ou par une partie pyridinium endocyclique. Ces fonctionnalités sont généralement quaternisées par alkylation ou protonation. Dans ce dernier cas, cependant, cela conduit à une influence significative du pH sur les propriétés de liaison à l'ADN. En revanche, les colorants cationiques avec un quaternaire endocyclique tête de pont l'atome d'azote sont assez rares et peu d'études systématiques existent pour cette classe de composés. Dans cet article, nous résumerons les études sur les propriétés de liaison à l'ADN des dérivés de quinolizinium (schéma 1) (22) comme exemples représentatifs de colorants avec un atome d'azote en tête de pont quaternaire, et nous démontrerons que les dérivés de quinolizinium annelés peuvent servir de plate-forme utile. pour la conception de colorants intercalants.


MATÉRIAUX ET MÉTHODES

Matériaux

Nucléase P1 (de Pénicillium citrinum ) a été acheté auprès de Calbiochem, EMB Biosciences, Inc. (San Diego, CA). L'ADN de thymus (ct) de veau, la phosphodiestérase de venin de serpent et la phosphodiestérase de rate de veau ont été obtenus auprès de Sigma Chemical Co. (St Louis, MO). La phosphatase alcaline a été achetée auprès de Roche Diagnostics Corporation (Indianapolis, IN). 2′-Déoxyadénosine-5′-triphosphate-1,3,7,9-15 N 4 -(4-amino-15 N) (dATP-15 N 5 ) et 2'-désoxyguanosine-5'-triphosphate-1,3,7,9-15 N 4 -(2-amino-15 N) (dGTP-15 N 5 ) provenaient de Medical Isotopes, Inc. (Pelham, NH). (5′ S )-cdA a été obtenu auprès de Berry & Associates, Inc. (Ann Arbor, MI). L'acétonitrile (qualité HPLC) provenait de Burdick et Jackson (Muskegon, MI). Les membranes d'ultrafiltration Biomax5 (seuil de masse moléculaire de 5 kDa) ont été achetées auprès de Millipore (Bedford, MA). L'eau (qualité HPLC) pour les analyses LC/MS provenait de J.T. Baker (Phillipsburg, NJ). De l'eau purifiée par un système Milli-Q (Millipore) a été utilisée pour toutes les autres applications. 2′-Déoxyadénylyl(3′→5′)-(5′ S )-8,5′-cyclo-2′-désoxyadénosine 3′-monophosphate [d(AcA)-3′-p], 2′-désoxycytidylyl(3′→5′)-(5′ S )-8,5′-cyclo-2′-désoxyadénosine 3′-monophosphate [d(CcA)-3′-p], 2′-désoxyguanylyl(3′→5′)-(5′ S )-8,5′-cyclo-2′-désoxyadénosine 3′-monophosphate [d(GcA)-3′-p] et 2′-désoxythymidylyl(3′→5′)-(5′ S )-8,5′-cyclo-2′-désoxyadénosine 3′-monophosphate [d(TcA)-3′-p], et des oligodésoxynucléotides contenant (5′ S )-cdA et sans groupes phosphates terminaux ont été synthétisés comme décrit ailleurs (10, 20).

Irradiation de l'ADN

Une solution aqueuse tamponnée d'ADN (tampon phosphate 10 mM, pH 7,4, 0,3 mg/ml) a été saturée de N 2 O et irradié avec des rayons gamma dans une source gamma de 60 Co à une dose de 2 Gy (débit de dose 24 Gy/min). Par la suite, les solutions d'ADN irradiées et non irradiées ont été dialysées contre de l'eau pendant 18 h. L'eau à l'extérieur des tubes de dialyse a été changée trois fois au cours de la dialyse. Des aliquotes de 50 µg d'ADN ont été séchées dans un SpeedVac sous vide.

Isolement de l'ADN du foie de porc

Le foie de porc congelé a été obtenu auprès de Pel-Freeze, Inc. (Rogers, AK). Deux méthodes d'isolement de l'ADN ont été utilisées. La première méthode (méthode phénol-chloroforme) était essentiellement celle décrite précédemment (21). Brièvement, les tissus ont été homogénéisés dans 10 volumes de tampon d'homogénéisation (1% SDS + 1 mM EDTA), puis 500 ug/ml de protéinase K ont été ajoutés et incubés pendant 30 min à 37°C. Les homogénats ont ensuite été extraits au phénol, au phénol-Sevag (chloroforme/alcool isoamylique dans le rapport 24:1), puis au Sevag. L'ADN a été précipité avec 1 vol. d'éthanol froid et dissous dans 0,01 x SSC (1,5 mM de NaCl, 0,15 mM de citrate de sodium, pH 8,0). L'ADN a été traité avec la RNase T1 (50 U/ml) et les RNases A (50 ug/ml) pendant 30 min à 37°C, puis extrait avec des volumes égaux de Sevag. L'ADN a été précipité de la couche aqueuse en utilisant de l'éthanol froid et lavé avec de l'éthanol à 70 %. L'ADN a ensuite été dissous dans 0,01 x SSC à environ 1 mg/ml. Nous avons également testé l'effet de l'ajout de 1,25 mM de desféroximine (Sigma) au tampon d'homogénéisation avant l'homogénéisation.

La deuxième méthode était une méthode d'extraction à haute teneur en sel telle que décrite précédemment (22, 23). Le tissu congelé (1 g) a été homogénéisé dans 8 ml de solution de lyse (0,5 M de Tris, pH 8,0, 20 mM d'EDTA, pH 8,0, 10 mM de NaCl, 1 % de SDS). De la protéinase K (0,5 mg/ml) a été ajoutée au mélange suivi d'une incubation pendant une nuit à 37°C. Le jour suivant, 4 ml de solution saturée de NaCl ont été ajoutés au mélange, qui a été mélangé au vortex pendant 1 min, puis incubé à 56°C pendant 15 min. Le mélange a été centrifugé pendant 30 min avec 16 000 g et le surnageant a été récupéré. Après une autre centrifugation, l'ADN dans le surnageant a été précipité en utilisant 1 vol. d'éthanol froid, lavé avec de l'éthanol à 70 % et dissous dans 0,01 x SSC. L'ADN a ensuite été traité avec des RNases, extrait avec Sevag, précipité et dissous comme décrit ci-dessus.

Hydrolyse enzymatique des dinucléotides, des oligodésoxynucléotides et de l'ADN

Pour l'hydrolyse enzymatique, 2 pmol de (5′ S )-cdA-15N 5 en tant qu'étalon interne a été ajouté à 100 pmoles de dinucléotides et d'oligodésoxynucléotides. Les montants de (5 S )-cdA-15N 5 ajoutés à 50 g d'échantillons d'ADN-ct non irradiés et irradiés étaient de 0,2 et 1 pmol, respectivement. Après ajout de l'étalon interne, les dinucléotides, les oligodésoxynucléotides et les échantillons d'ADN ont été séchés dans un SpeedVac sous vide, puis dissous dans 50 l de solution Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) complétée par 2,5 l d'acétate de sodium 1 M contenant 45 mM ZnCl 2 (pH final de 6,0). Des aliquotes de nucléase P1 (5 U), de phosphodiestérase de venin de serpent (0,004 U) et de phosphatase alcaline (32 U) ont été ajoutées et les échantillons ont été incubés à 37°C pendant 6, 24 ou 48 h. Dans certains cas, la phosphodiestérase de rate (0,004 U) a également été utilisée. Les groupements 3'-phosphate des dinucléotides ont été éliminés par hydrolyse à la phosphatase alcaline pendant 6 h de la même manière pour obtenir les dinucléosides monophosphates d(AcA), d(CcA), d(GcA) et d(TcA). Après hydrolyse, les échantillons ont été filtrés à l'aide de membranes d'ultrafiltration avec un seuil de masse moléculaire de 5 kDa par centrifugation à 6000 g pendant 30 minutes.

Pour déterminer si les conditions d'hydrolyse enzymatique utilisées dans les 32 études post-marquage rapportées précédemment (20) libéreraient également (5′ S )-cdA, 100 pmoles de dinucléotides ou oligodésoxydinucléotides ont été incubées dans 10 l d'une solution contenant 30 mM de succinate de sodium (pH 6), 10 mM de CaCl 2 , 500 mU de nucléase micrococcale et 10 mU de phosphodiestérase de rate (Worthington Biochemicals, Vineland, NJ). La digestion s'est poursuivie pendant 3,5 h à 37°C. Ensuite, 4 l d'une solution contenant 225 mM d'acétate de sodium (pH 5,0), 0,55 mM de ZnCl 2 et 5,6 ug de nuclease P1 ont été ajoutés et l'incubation a été poursuivie pendant 45 minutes à 37°C. La réaction a été neutralisée en ajoutant 2,6 µl de tampon CHES [acide 2-(cyclohexylamino)éthanesulfonique] 0,75 M (pH 9,7) et les échantillons ont été congelés sur glace sèche. Les échantillons ont ensuite été décongelés et traités avec de la phosphatase alcaline comme décrit ci-dessus.

Analyse par LC/MS

L'analyse par LC/MS avec le processus API-ES utilisant la technique de dilution isotopique et la surveillance des ions sélectionnés (SIM) a été réalisée comme décrit précédemment (17). Une colonne à phase inversée Zorbax Eclipse XDB C18 (15 cm × 2,1 mm de diamètre intérieur, 5 m de granulométrie) (Agilent Technologies, Rockville, MD) a été utilisée. Une colonne de garde garnie de la même phase stationnaire (1 cm × 2,1 mm de d.i.) a été fixée à la tête de colonne. Le solvant A était un mélange d'eau et d'acétonitrile (98:2, v/v) et le solvant B était 100 % d'acétonitrile. Un gradient de 0,5 % du solvant B par minute a été utilisé. Le débit était de 0,2 ml/min. La température de la colonne a été maintenue à 30°C. L'étalon interne marqué par un isotope (5′ S )-8,5′-cyclo-2′-désoxyadénosine-1,3,7,9-15 N 4 -(4-amino-15 N) [(5′S)-cdA-15 N 5 ] a été préparé en utilisant dATP-15 N 5 comme décrit précédemment (18). Des aliquotes (20 pi) d'hydrolysats enzymatiques filtrés ont été injectés sur la colonne LC sans autre traitement. Lorsque nécessaire, les effluents ont été passés à travers un spectrophotomètre UV pour le suivi de l'absorbance de (5′ S )-cdA et dinucléosides monophosphates, avant leur introduction dans la chambre à ions du spectromètre de masse. L'identification et la quantification de la 8-hydroxy-2′-désoxyguanosine (8-OH-dG) et de la 8-hydroxy-2′-désoxyadénosine (8-OH-dA) ont été effectuées comme décrit ailleurs (24, 25). Les étalons internes marqués isotopiquement 8-OH-dG-15 N 5 et 8-OH-dA-15 N 5 ont été isolés à partir de solutions irradiées aux rayons gamma de dGTP-15 N 5 et dATP-15 N 5 , respectivement, en utilisant la LC semi-préparative et la même procédure que celle décrite précédemment pour l'isolement de (5′ S )-cdG-15N 5 et (5′ S )-cdA-15N 5 ( 18 ).


Affiliations

State Key Laboratory of Pollution Control and Resource Reuse, College of Environmental Science and Engineering, Tongji University, Shanghai, 200092, RP, Chine

Xian Zhang, Ling Chen et Hong-Wen Gao

Laboratoire clé de l'environnement aquatique du fleuve Yangtze du ministère de l'Éducation, Collège des sciences et de l'ingénierie de l'environnement Tongji University, Shanghai, RP, Chine, 200092

Collège d'ingénierie de l'environnement, Université forestière de NanJing, Nanjing, 210037, RP, Chine


Voir la vidéo: La Réplication de LADN 23: La polymérisation fabrication des nouveaux brins dADN (Juin 2022).


Commentaires:

  1. Bean

    Harnais des démons

  2. Seif

    Science fiction :)

  3. Quaid

    Ça ne me dérange pas.

  4. Jorrell

    Belle réponse



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