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Technique pour tester la résistance aux antibiotiques d'une bactérie en présence d'un autre composé

Technique pour tester la résistance aux antibiotiques d'une bactérie en présence d'un autre composé


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je dois donc évaluer «quantitativement» une souche bactérienne pour sa propriété de résistance aux antibiotiques (c'est un antibiotique spécifique) en présence et en l'absence d'un autre composé à côté de l'antibiotique. Quelle technique ou quel protocole peut-on suivre ?


Il semble que vous puissiez utiliser un "test de diffusion de disque" décrit dans cet article de Wikipédia. Elle pourrait être réalisée avec et sans le composé adjuvant secondaire et être quantifiée par la mesure des diamètres variables des zones résultantes d'inhibition bactérienne.

https://en.wikipedia.org/wiki/Disk_diffusion_test


Résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des écloseries de crevettes et des étangs de culture sur l'île de Donghai, Chine

La résistance des bactéries à 12 antibiotiques différents a été étudiée dans des élevages de crevettes sur l'île de Donghai, en Chine. Les bactéries résistantes aux antibiotiques se sont avérées répandues dans les élevages de crevettes, ce qui indique un risque environnemental élevé. De plus, des différences significatives ont été trouvées dans les souches bactériennes entre les fermes (ANOVA, p < 0,05), montrant une résistance aux antibiotiques tels que l'ampicilline, le triméthoprime, le composé sinomi, la tétracycline, le chloramphénicol et la céfazoline. Aucune différence significative dans la résistance aux antibiotiques n'a été trouvée parmi les 6 couvoirs évalués dans cette étude (ANOVA, p > 0,05), entre étangs crevettiers exaltés et traditionnels (ANOVA, p > 0,05), et entre les étangs de culture et les sites de sources d'eau de contrôle correspondants (T-test, p > 0,05). Dans les étangs de culture, aucune différence significative dans la résistance bactérienne aux antibiotiques n'a été trouvée entre l'eau et les sédiments (T-test, p > 0,05), et la résistance aux antibiotiques des bactéries de l'eau a montré une corrélation positive significative avec celle des sédiments (p < 0.05). Par conséquent, notre étude indique que la résistance bactérienne multiple aux antibiotiques (MAR) est plus répandue dans les écloseries de crevettes que dans les étangs.

Points forts

► Nous évaluons l'incidence de la résistance antibactérienne à 12 antibiotiques sur l'île de Donghai, en Chine. ► Les utilisations d'antibiotiques sont nombreuses dans les étangs et les écloseries de crevettes. ► Les bactéries résistantes aux antibiotiques sont répandues en raison de la pollution croisée, indiquant un risque environnemental élevé.


INTRODUCTION

L'identification et l'utilisation des plantes médicinales sont des éléments importants de la santé et du bien-être de diverses populations dans le monde en développement. De plus, les plantes qui ont des propriétés antibactériennes deviennent de plus en plus pertinentes à une époque où les professionnels de la santé documentent la résistance croissante aux antibiotiques parmi les bactéries pathogènes. Moringa oleifera (moringa) est un arbre originaire d'Inde qui a été utilisé à la fois comme complément nutritionnel et comme plante médicinale (1&# x020135). Sur la base de nos propres recherches (non publiées) et de celles de plusieurs autres groupes (4, 6𠄸), des extraits de feuilles, de graines et de racines de moringa présentent des propriétés antibactériennes. Allium sativum (ail) a également été montré pour présenter des qualités antibactériennes (9, 10). Ces effets inhibiteurs peuvent être facilement démontrés dans un exercice de laboratoire instructif et très visuel.

Plusieurs méthodes peuvent être utilisées pour déterminer les effets antibactériens de différentes substances, mais la méthode de diffusion sur disque (11) est l'une des techniques les plus rentables, directes et visuellement frappantes disponibles. Cette méthode donne des résultats clairs qui sont facilement observés et interprétés par les étudiants effectuant l'expérience. Ici, nous décrivons une activité de laboratoire dans laquelle les étudiants ont appris comment extraire des composés antibactériens des plantes, plaquer des bactéries de manière aseptique et tester les extraits pour l'activité antibactérienne. Après une période d'incubation de 24 heures, les étudiants ont analysé leurs résultats et collecté des données concernant l'effet inhibiteur des extraits de plantes testés sur la croissance des bactéries gram-positives et gram-négatives.

Les étudiants ont reçu un quiz non annoncé identique immédiatement avant (pré-laboratoire) et une semaine après (post-laboratoire) l'activité de laboratoire pour évaluer si leur compréhension des concepts et des procédures s'est améliorée après avoir effectué l'exercice de laboratoire. Les étudiants ont également fourni une évaluation de l'activité de laboratoire en remplissant un sondage post-laboratoire.

Public visé

En raison de sa nature multidisciplinaire, combinant des concepts de la microbiologie et de la biologie végétale, cette activité de laboratoire est appropriée pour une gamme de cours de biologie de premier cycle. Ceux-ci peuvent inclure des cours de type « principes de biologie » de première année, de biologie végétale (botanique), de microbiologie générale et de microbiologie médicale. Ce serait également une activité appropriée pour tout cours portant sur les plantes médicinales, la biologie de la conservation ou l'agriculture tropicale.

Connaissances préalables des étudiants

Les étudiants de premier cycle qui ont terminé avec succès les cours de biologie du secondaire doivent avoir des connaissances de base suffisantes pour effectuer cette activité, en supposant qu'un cours pré-laboratoire couvrant les concepts de base de la culture bactérienne et de la structure cellulaire (gram-positif contre gram-négatif) est également fourni (voir “Instructions de la faculté”). En outre, les étudiants doivent avoir satisfait aux exigences de sécurité en laboratoire du cours, qui devraient inclure la couverture des directives pour l'utilisation des organismes de niveau de biosécurité (BSL) 1 (voir “Problèmes de sécurité”). À partir de leur formation terminée, les étudiants auront une compréhension de base de la croissance microbienne et du contrôle de la croissance et une maîtrise de la manipulation sûre des micro-organismes vivants, y compris l'utilisation de techniques aseptiques et l'élimination appropriée des matériaux présentant un risque biologique. Les instructeurs devraient revoir ces concepts pendant l'explication et la démonstration pré-laboratoire.

Temps d'apprentissage

Pour terminer cette activité, une période de laboratoire de deux heures est nécessaire pour collecter les extraits de plantes, tamponner des plaques stériles de gélose Mueller-Hinton avec les cultures bactériennes fournies et placer l'extrait de plante et les disques infusés d'antibiotiques sur les plaques pour incubation à 37& #x000b0C. Après une incubation de 24 heures, soit les résultats expérimentaux doivent être collectés immédiatement par les étudiants, soit les cultures sur plaque doivent être réfrigérées à 4 ° C pour la collecte des données au cours de la prochaine période de laboratoire. Les élèves devraient être capables de mesurer et d'interpréter leurs résultats en 15 à 30 minutes.

Objectifs d'apprentissage

Après avoir réussi cet exercice de laboratoire, les étudiants seront capables de :

Extraire les produits hydrosolubles de plantes à valeur médicinale potentielle et déterminer leur activité antibactérienne.

Établir des cultures bactériennes sur des boîtes de Pétri en utilisant une technique aseptique.

Quantifiez les effets antibactériens des extraits de plantes et des antibiotiques connus en identifiant, mesurant et comparant les zones d'inhibition de la croissance sur une culture bactérienne sur plaque.

Comparez les effets inhibiteurs de croissance des extraits de plantes et des antibiotiques connus sur une bactérie gram-positive par rapport à une bactérie gram-négative.

Formuler une hypothèse pour expliquer la fonction des produits antimicrobiens dans les plantes.

Articuler les utilisations potentielles des plantes pour lutter contre les infections bactériennes.


2. Définition et méthodes

2.1. Qu'est-ce que le MIC ?

La CMI est la concentration la plus faible d'un agent antibactérien exprimée en mg/L (μg/mL) qui, dans des conditions in vitro strictement contrôlées, empêche complètement la croissance visible de la souche d'essai d'un organisme [2].

2.2. Méthodes de détermination de la CMI

Les méthodes suivantes sont utilisées :

bandelettes imprégnées d'un gradient de concentration prédéfini d'antibiotique

2.2.1. Méthodes de dilution

EUCAST [3] recommande principalement la microdilution en bouillon, à l'exception de la fosfomycine et du mécillinam pour lesquels il recommande la dilution en gélose. Le CLSI américain [4], en revanche, admet l'utilisation interchangeable de la dilution en bouillon et en gélose pour la plupart des bactéries et des antibiotiques. Les exceptions sont H. influenzae souches et antibiotiques colistine et daptomycine pour lesquels la CMI ne peut être déterminée que par dilution en bouillon et fosfomycine pour lesquelles, comme dans les documents d'orientation de l'EUCAST, la CMI peut être mesurée à l'aide de la méthode de dilution en gélose. De plus, CLSI recommande le support HTM pour H. influenzae au lieu du milieu de bouillon MH𠄿 recommandé par EUCAST.

Pour déterminer les valeurs de CMI, toutes les méthodes quantitatives utilisent le milieu Mueller–Hinton (MH) soit sous forme de gélose (MHA) ou de bouillon (MHB), dans certains cas en plus complété avec, par exemple, 5% de sang de cheval lysé ou d'autres composés en fonction sur les bactéries ou le type d'antibiotique ( Tableau 1 ). Uniquement pour les bactéries anaérobies, la gélose Brucella avec hémine (5 µg/mL), vitamine K (1 µg/mL) et 5% de sang de cheval lysé est utilisée [4,5].

Tableau 1

Milieu, supplémentation supplémentaire et souches témoins pour la détermination de la CMI par les méthodes de dilution selon EUCAST [3].

Souches bactériennesDétermination de la CMISouches de contrôle
Dilution de bouillonDilution en gélose
Bouillon Mueller-Hinton (MHB)MHB + sang de cheval défibriné et β-NAD (MH-F)Supplémentation supplémentaireMHASupplémentation supplémentaire
Entérobactériestous les antibiotiques sauf la fosfomycine et le mécillinam--fosfomycineMHA + 25 mg/L glucose-6-phosphateE. coli ATCC 25922, inhibiteurs uniquement :
ATCC E. coli 35218 ou
K. pneumoniae 700603
Entérobactériestous les antibiotiques sauf la fosfomycine et le mécillinam--mécillinam-E. coli ATCC 25922, inhibiteurs uniquement :
ATCC E. coli 35218 ou K. pneumoniae 700603
Pseudomonas spp.tous les antibiotiques sauf la fosfomycine --fosfomycine MHA + 25 mg/L glucose-6-phosphateP. aeruginosa
ATCC 27853
Stenotrophomonas maltophiliacotrimoxazole----E. coli ATCC 25922
Acinetobacter spp.tous les antibiotiques----P. aeruginosa
ATCC 27853
Staphylocoque spp.tous les antibiotiques sauf la fosfomycine-MHB + 2% NaCl pour oxacilline, méthicilline, nafcillinefosfomycine MHA + 25 mg/L glucose-6-phosphateS. aureus
ATCC 29213
Staphylocoque spp.tous les antibiotiques sauf la fosfomycine-MHB + 50 mg/L Ca++ pour la daptomycine--S. aureus
ATCC 29213
Staphylocoque spp.tous les antibiotiques sauf la fosfomycine-MHB + 0,002 % polysorbate 80 pour dalbavancine, oritavancine, télévancine--S. aureus
ATCC 29213
Entérocoque spp.tous les antibiotiques----E. faecalis
ATCC 29212
Streptocoque A,B, C,G gr.-tous les antibiotiquesBouillon MH-F + 0,002 % polysorbate 80 pour dalbavancine, oritavancine, televanci--S. pneumoniae
ATCC 49619
Streptococcus pneumoniae-tous les antibiotiques---S. pneumoniae
ATCC 49619
Streptocoque gr. viridans-tous les antibiotiquesBouillon MH-F + 0,002 % polysorbate 80 pour dalbavancine, oritavancine, televanci--S. pneumoniae
ATCC 49619
Haemophilus
la grippe
-tous les antibiotiques---H. influenzae
ATCC 49766
Moraxelle
catarrhalis
-tous les antibiotiques---H. influenzae
ATCC 49766
Listeria
monocytose
enes
-tous les antibiotiques---S. pneumoniae
ATCC 49619
Pasteurelle
multocida
-tous les antibiotiques---H. influenzae
ATCC 49766
Corynébactérie spp. -tous les antibiotiques---S. pneumoniae
ATCC 49619
Kingella kingae -tous les antibiotiques---H. influenzae
ATCC 49766
Aeromonas
sanguinicola et urines
-tous les antibiotiques---P. aeruginosa
ATCC 27853

Pour déterminer la CMI par des méthodes de dilution, des antibiotiques sont également nécessaires dans une substance qui nécessitent une dissolution préalable pour obtenir une solution mère, puis une dilution pour obtenir une concentration de départ appropriée. Pour la plupart des antibiotiques, l'eau est à la fois un solvant et un diluant, y compris pour la plupart des bêta-lactamines, des fluoroquinolones et des aminosides. Certains nécessitent de l'alcool comme solvant, en particulier des macrolides, du chloramphénicol et de la rifampicine, tandis que d'autres nécessitent un tampon phosphate ou du diméthylsulfoxyde DMSO (tableau 2). Des antibiotiques dissous et dilués sont utilisés pour préparer des solutions de travail dans du bouillon ou de la gélose Mueller-Hinton [6,7].

Tableau 2

Solvants et diluants pour différents antibiotiques [6].

AntibiotiquesSolvantDiluant
pénicillinespénicilline, méthicilline, nafcilline, oxacilline, azlocilline, mécillinam, mezlocilline, carbénicilline, pipéracillinel'eau
amoxicilline, ticarcillinetampon phosphate pH 6,0, 0,1 mol/L
ampicillinetampon phosphate pH 8,0, 0,1 mol/Ltampon phosphate pH 8,0,
0,1 mol/L
inhibiteurs des bêta-lactamines
des bêta-lactamases
sulbactam, tazobactam,l'eau
Acide clavulanique,tampon phosphate pH 6,0, 0,1 mol/L
inhibiteurs non bêta-lactamines des bêta-lactamasesavibactam, relebactaml'eau
céphalosporinescéfaclor, céfamandole, céfonicide, céfopérazone, céfotaxime, céfoxitine, ceftozoxime, ceftoplozane, ceftriaxonel'eau
céfazoline, céfépime, céfuroximetampon phosphate pH 6,0, 0,1 mol/L
ceftazidimele carbonate de sodiumL'eau
ceftarolineDMSOSaline
céphalexine, céphalotine, céphradinetampon phosphate pH 8,0, 0,1 mol/Ll'eau
carbapénèmesfaropenem, méropéneml'eau
ertapénèmetampon phosphate pH 6,0, 0,1 mol/L
imipénème, ertapénèmetampon phosphate pH 7,2, 0,01 mol/L
méropénem-varborbactamDMSOl'eau
aminosidesamikacine, gentamicine, kanamycine, nétilmicine, streptomycine, plazomicine, tobramycinel'eau
lincosamidesclindamycinel'eau
macrolidesazitromycine95% d'éthanolmilieu de bouillon
clarythromycineméthanoltampon phosphate pH 6,5, 0,1 mol/L
érythromycine95% d'éthanoll'eau
quinolonescinafloxacine, finafloxacine, garenoxacine, gatifloxacine, gémifloxacine, moxifloxacine, sparfloxacine, ofloxacine*, lévofloxacine*, norfloxacine*l'eau
tétracyclinestétracycline, minocycline, doxycycline, tigécycline, eravacyclinel'eau
polymyxinescolistine, polymyxine Bl'eau
glycopeptidesteicoplanine, vancomycinel'eau
télavancineDMSO
lipoglycopeptidesdalbavancineDMSO
lipopeptide cycliquedaptomycinel'eau
oxazolidinoneslinézolidel'eau
tédizolideDMSO
autres antibiotiquesfosfomycine, acide fusidique, mupirocine, quinupristine-dalfopristine, l'eau
fidaxomicine, métronidazoleDMSOl'eau
chloramphénicol95% d'éthanoll'eau
rifampicineméthanol l'eau

* 1/2 volume d'eau, puis 0,1 mol/L de NaOH goutte à goutte pour dissoudre, DMSO𠅍iméthylsulfoxyde.

Les solutions de travail doivent contenir des doubles dilutions d'antibiotiques, avec la gamme de concentrations utilisées pour les tests en fonction du médicament concerné et doivent prendre en compte les seuils de CMI pour les souches de référence [6]. Les doubles dilutions ultérieures de l'antibiotique doivent être réalisées selon les schémas disponibles dans les documents [6] et proposés par EUCAST [8].

Dans la méthode de microdilution en bouillon, les solutions de travail préparées avec des doubles dilutions d'antibiotiques sont réparties dans des puits appropriés de plaques de microtitration, et sous cette forme, elles peuvent être soit utilisées directement pour les déterminations de la CMI, soit conservées dans des sacs en plastique jusqu'à trois mois à une température ≤ � ଌ [6]. La tigécycline est une exception pour laquelle le test de CMI doit avoir lieu dans les 12 h suivant la préparation du milieu MHB. Cela est dû au fait qu'au fil du temps, le milieu accumule de l'oxygène, ce qui réduit à son tour l'activité de la tigécycline [3,4,6,9].

Dans la méthode de dilution en gélose, chacune des concentrations d'antibiotiques obtenues à un volume de 1 mL est ajoutée à 19 mL de milieu MHA encore liquide à une température de 45�ଌ et est versée sur des boîtes de Pétri d'un diamètre de 9 cm [8].

Inoculum bactérien

La suspension bactérienne doit être préparée à partir de colonies morphologiquement similaires cultivées pendant la nuit sur un milieu solide ou liquide non sélectif. L'inoculum à traiter avec les dilutions ultérieures de l'antibiotique doit avoir les valeurs finales suivantes dans les méthodes respectives :

méthode de microdilution en bouillon 5 × 10 5 UFC (unités formant colonie) /mL [6]

méthode de dilution en gélose 1 × 10 4 UFC/spot [7,8]

Pour obtenir l'une des suspensions bactériennes ci-dessus, une suspension de 0,5 McFarland doit d'abord être préparée.

Pour obtenir une suspension bactérienne avec une densité de 5 × 10 5 CFU/mL aux fins de la microdilution du bouillon, 0,5 suspension McFarland doit être diluée 100× à une densité de 10 6 CFU/mL (9,9 mL de bouillon + 0,1 mL 0,5 suspension McFarland) puis versé dans des puits contenant les concentrations appropriées d'antibiotiques dans le bouillon (50 μL d'inoculum bactérien + 50 milieu liquide avec antibiotique ou 10 μL d'inoculum pour 100 μL d'antibiotique dilué). Si des tests commerciaux avec un antibiotique lyophilisé sont utilisés dans les puits, une suspension de 5 × 10 5 doit être obtenue immédiatement en ajoutant 50 μL de 0,5 suspension McFarland à 10 mL de bouillon). S. pneumoniae nécessite un transfert de 100 μL de 0,5 suspension McFarland dans 10 mL de bouillon pour obtenir un inoculum final de 5 × 10 5 UFC/mL [10].

Pour la méthode de dilution en gélose, l'inoculum final 1 × 10 4 UFC/spot est obtenu en diluant la suspension à 0,5 McFarland 10× dans du NACL ou du bouillon et en déposant 1 μL de cette suspension sur le milieu MHA avec des dilutions d'antibiotiques ultérieures [8].

Dans les 30 minutes suivant la préparation, l'inoculum doit être ajouté au milieu liquide ou placé sur un milieu solide avec l'antibiotique afin que la densité cellulaire (CFU/mL) soit maintenue. Les tests doivent être incubés à 35 ± 1 ଌ pendant 18� h (24 h complets sont nécessaires notamment pour les glycopeptides et pour l'oxacilline [6] ainsi que pour les tests Streptocoque spp. et Haemophilus spp. souches [10]. L'incubation doit être effectuée dans des conditions aérobies. Uniquement dans des cas exceptionnels, pour des souches telles que Neisseria spp., l'incubation est conduite dans une atmosphère enrichie avec 5% de CO2 [8] ou pour les bactéries anaérobies elle se fait en conditions anaérobies et pendant 48 h [5].

L'inoculum bactérien doit être contrôlé car il a un impact majeur sur la fiabilité des tests MIC. L'obtention de 0,5 McFarland suspension est contrôlée par des mesures dans un densitomètre ou un spectrophotomètre, où l'absorbance à une longueur d'onde de 625 nm doit être comprise entre 0,08 et 0,13 [9,11]. L'inoculum obtenu dans les puits des plaques de microtitration doit également être contrôlé. À cette fin, lors de l'utilisation de la microdilution en bouillon, 10 µl doivent être prélevés dans le puits de contrôle de croissance (milieu MHB avec suspension bactérienne et sans antibiotique) et ajoutés à 10 ml de bouillon ou de sel, puis 100 µl de cette dilution doit être placé sur un milieu solide, bien étalé sur le milieu MHA et incubé pendant 12� h à 35 ± 1 ଌ. L'obtention d'une croissance de 20 � colonies d'une souche bactérienne donnée prouve la densité de 5 × 10 5 UFC/mL [6].

Dans chacune des méthodes, un contrôle qualité doit être effectué en contrôlant la stérilité du milieu, la croissance des souches et la qualité des résultats obtenus en évaluant la CMI de l'antibiotique testé pour les souches de référence dont la liste est donnée dans le tableau 1 . Les souches de référence répertoriées dans le tableau 1 sont recommandées à la fois par l'EUCAST et le CLSI [3,4]. Les valeurs de CMI obtenues pour les souches de référence doivent se situer dans la plage de concentrations recommandées par l'EUCAST et le CLSI [4,12].

Lecture des résultats

La valeur MIC est la concentration la plus faible d'un antibiotique à laquelle la croissance bactérienne est complètement inhibée. Dans la méthode de dilution en gélose, la croissance de colonies 1𠄲 ou un léger voile sont ignorés [7,8]. Dans la méthode de microdilution en bouillon, pour certains antibiotiques, des règles distinctes de lecture de la valeur de la CMI sont utilisées [13], notamment pour les éléments suivants :

antibiotiques bactériostatiques contre les bactéries Gram-positives (chloramphénicol, tétracycline, clindamycine, érythromycine, linézolide, tédizolide) et contre les organismes Gram-négatifs (tygécycline, eravacycline) : ne pas tenir compte de la croissance précise au fond du puits

triméthoprime-sulfaméthoxazole pour toutes les bactéries : lire la CMI à la concentration la plus faible qui inhibe �% de la croissance par rapport au témoin de croissance.

Pour faciliter la lecture dans la méthode de microdilution en bouillon, la résazurine (un colorant bleu faiblement fluorescent) peut être utilisée, qui est réduite par des bactéries actives en résorufine fluorescente (rose) [14]. Les tests dans lesquels aucune croissance n'est observée à des concentrations d'antibiotiques plus faibles et une croissance visible de bactéries est observée à des concentrations plus élevées doivent être répétés. Cela peut être dû à plusieurs raisons, y compris des erreurs techniques associées, par exemple, à une dilution inappropriée des antibiotiques. Cependant, la raison de l'effet Eagle est beaucoup plus engageante. Il s'agit de bactéries, qui ont paradoxalement une capacité de survie accrue en présence d'une concentration bactéricide d'antibiotique supérieure à l'optimum [15]. Ce phénomène a été décrit pour la première fois par le scientifique Harry Eagle en 1948 à propos de la pénicilline. Actuellement, l'effet Eagle est trouvé pour un certain nombre d'antibiotiques comme les bêta-lactamines, les glycopeptides, les fluoroquinolones, les aminosides, les polymyxines, la rifampicine. On l'observe également en cas de divers micro-organismes, notamment Staphylocoque spp., Streptocoque spp., Entérocoque spp., et les bactéries Gram-négatives, en particulier les bactéries bêta-lactamases positives. Fait intéressant, cela ne se produit ni pour les bactéries bêta-lactamases négatives ni en présence d'inhibiteurs de bêta-lactame. En milieu clinique, l'effet Eagle conduit à l'échec du traitement en raison de l'application d'une dose excessive d'antibiotique. Des études ont montré que des concentrations de vancomycine de 20 × CMI ou plus s'appliquaient contre E. faecalis ou Clostridium difficile ont contribué à l'effet bactériostatique plutôt que bactéricide du glycopeptide. En revanche, des concentrations allant jusqu'à 9 × CMI étaient efficaces et ont entraîné des résultats cliniques positifs [16,17]. Les mécanismes sous-jacents à l'effet Eagle ne sont pas entièrement compris. L'attention scientifique se concentre sur une possible augmentation de la production de bêta-lactamases en raison d'une concentration élevée d'antibiotique, d'une expression diminuée des PBP (protéines de liaison à la pénicilline) dans la phase stationnaire des bactéries ou du stress oxydatif induit par les quinolones [15].

2.2.2. Méthode du dégradé

La détermination de la CMI à l'aide de la méthode du gradient est beaucoup moins compliquée que les méthodes de dilution. L'utilisation de bandelettes de test E imprégnées d'un gradient prédéfini de concentrations d'antibiotiques rend la méthode simple, rapide et applicable dans les diagnostics microbiologiques de routine. Malheureusement, ces dernières années, l'utilisation de la méthode de diffusion sur disque utilisant des bandes a été considérablement réduite. Il s'est avéré qu'il produit des déterminations peu fiables de la sensibilité à la colistine et à la vancomycine chez Staphylococcus spp. ou à la fosfomycine [3,4]. Dans le cas de la colistine, cette méthode produit généralement des valeurs de CMI inférieures à la méthode de microdilution en bouillon de référence. Par conséquent, il ne permet généralement pas l'identification de souches résistantes [18,19,20]. Ce qui précède s'explique à la fois par la taille de la molécule de polymyxine (c'est la raison pour laquelle elle a des possibilités de diffusion limitées à partir de la bande) et par une éventuelle interaction avec le plastique dont est faite la bande [21,22]. En mai 2019, un avertissement a également été publié sur le site web de l'EUCAST concernant la possibilité d'obtenir des résultats faussement négatifs lors de l'utilisation de tests de gradient dans l'évaluation de la résistance à la vancomycine des souches du genre Entérocoque spp. et dans l'évaluation de la sensibilité des Streptococcus pneumoniae à la benzylpénicilline [23,24]. Le rejet de cette méthode pour la détermination de la CMI de certains antibiotiques a finalement conduit à une diminution de la délivrance de résultats incluant une évaluation de la sensibilité à la colistine ou à la fosfomycine de plus en plus courante. Elle n'a pas été remplacée par des méthodes de dilution car la plupart des laboratoires sont incapables de les mettre en œuvre dans leur travail de routine. Par conséquent, des recherches sont en cours pour évaluer la pertinence des bandelettes dans les tests de sensibilité aux médicaments bactériens en tenant compte de l'impact de divers facteurs sur les résultats. Ces dernières années, il a été rapporté que l'amélioration du milieu MHA avec du calcium pourrait améliorer la fiabilité de la détermination de la CMI de la colistine. Dans leurs études, Gwoឭziński et al. [25] ont montré un pourcentage élevé d'accord essentiel (EA) de la valeur de la CMI déterminée par la méthode du gradient sur milieu enrichi en calcium par rapport à la méthode de référence (microdilution en bouillon) mais uniquement pour les souches sensibles à la colistine. L'AE pour les souches résistantes était beaucoup plus faible (13 %), bien que l'accord catégorique (AC) était plus élevé et s'élevait à 87 %. Une étude récente des États-Unis publiée en 2020 [26] indique que la supplémentation en calcium n'apporte pas l'amélioration attendue de la fiabilité de la méthode du gradient dans la détermination de la CMI de la colistine, car l'EA et l'AC étaient respectivement de 65,5% et 73,7% pour tous les organismes Gram-négatifs testés, y compris ceux sensibles et résistants à la colistine. De même, des travaux sont en cours pour évaluer si le test de gradient ne permet pas réellement une évaluation fiable de la CMI de la fosfomycine. Les études menées jusqu'à présent offrent des résultats différents. Selon certains auteurs, les valeurs de CMI déterminées à l'aide de bandelettes réactives sont plus élevées que celles obtenues à l'aide de la méthode de référence, de sorte que les souches résistantes à la fosfomycine [27,28] sont plus souvent trouvées lorsque les bandelettes sont utilisées comme méthode de test. Flam et al. suggèrent que les souches résistantes à l'aide de bandelettes réactives doivent être vérifiées par le test de dilution en gélose [25]. Dans une autre étude, les auteurs italiens ont trouvé 100 % CA entre les méthodes de gradient et de référence pour E. coli ESBL(+) et Klebsiella pneumoniae NDM/OXA-48 [29]. Cependant, actuellement, le test de gradient n'est pas autorisé pour les déterminations de la CMI de la fosfomycine par les régulateurs américains [4] et l'EUCAST ne le recommande pas non plus comme méthode de référence [3], bien que certaines recommandations nationales (comme, par exemple, celles polonaises) permettent son demande [30].

La méthode du gradient nécessite une suspension de 0,5 McFarland pour tous les types de bactéries à l'exception de la suspension obtenue à partir de Streptococcus pneumoniae cultivées sur une plaque de gélose au chocolat pour laquelle 1 suspension McFarland doit être utilisée [3]. La lecture de la valeur MIC à l'aide de la bandelette de gradient E-test est plus compliquée que la réalisation du test lui-même. Elle peut dépendre de la souche bactérienne testée, de l'antibiotique (notamment s'il est bactériostatique ou bactéricide), du mécanisme de résistance, de la présence d'une population hétérogène résistante et même de la manière dont est réalisé le test E-test gradient strip test. Par conséquent, les évaluations de la CMI doivent être effectuées conformément aux instructions du fabricant qui tiennent compte de ces facteurs [31]. La fosfomycine mentionnée ci-dessus peut être un exemple ici, pour laquelle la croissance de colonies individuelles dans la zone d'inhibition de croissance ne doit pas être prise en compte dans la détermination de la valeur CMI [32].


Un moyen rapide de déterminer la résistance aux antibiotiques des bactéries

La capacité des bactéries à devenir résistantes aux antibiotiques est un problème croissant dans les soins de santé : les souches résistantes entraînent des maladies prolongées et des taux de mortalité plus élevés.

Une façon de lutter contre cela est de déterminer la résistance aux antibiotiques des bactéries chez un patient donné, mais cela prend souvent des jours - et le temps est crucial dans le traitement. Les scientifiques de l'ASU ont mis au point une technique qui peut trier les bactéries résistantes aux antibiotiques des bactéries "sensibles", et cela se produit en quelques minutes.

La technologie microfluidique, développée dans le laboratoire du professeur Mark Hayes du Département de chimie et de biochimie de l'Arizona State University, utilise des gradients de champ électrique à micro-échelle, agissant sur des échantillons extrêmement petits, pour faire la différence entre les deux souches (résistantes aux antibiotiques et aux antibiotiques -sensible) de Staphylocoque épiderme.

Cela fait partie d'une approche changeante des bactéries.

Après une approche de « marteau » de plusieurs décennies, axée sur l'élimination de toutes les bactéries via des savons, des détergents, des antibiotiques et des désinfectants pour les mains, les scientifiques se tournent maintenant vers des méthodes plus subtiles basées sur une meilleure compréhension du système bactérien complexe de notre corps et du monde qui nous entoure. nous.

L'humain moyen a plus de 100 000 milliards de microbes dans et sur son corps. C'est neuf fois le nombre de cellules qui composent l'ensemble du corps humain. Des armées de bactéries se faufilent dans notre corps dès notre naissance, des invités indésirables mais nécessaires. Nous ne pouvons pas faire sans eux.

Les bactéries ont, par évolution, la capacité d'adopter rapidement des altérations génomiques bénéfiques. Un type d'adaptation est la résistance aux antibiotiques, et cela devient un problème énorme et mondial.

Les données de synthèse nationales des Centers for Disease Control and Prevention indiquent que chaque année aux États-Unis, au moins 2 millions de personnes contractent des infections graves avec des souches de bactéries résistantes aux antibiotiques. Au moins 23 000 personnes meurent des suites directes de ces infections, et bien d'autres meurent de complications connexes.

Ce ne sont pas seulement les humains qui sont menacés par cette adaptation croissante. Une étude rapportée dans Science la semaine dernière, une grande variété d'animaux sauvages africains abritent des microbes résistants aux médicaments similaires à ceux trouvés chez les humains vivant dans les villages voisins.

L'adaptation à la résistance aux antibiotiques est un phénomène naturel. Lorsqu'un antibiotique est utilisé, les bactéries qui peuvent résister à cet antibiotique ont évidemment une plus grande chance de survie que celles qui y sont sensibles, et ainsi la résistance passe à la génération suivante.

Certaines des souches et espèces résistantes aux antibiotiques les plus notoires appartiennent au genre Staphylocoque. Ils sont généralement classés comme pathogènes ou non pathogènes sur la base de la production de l'enzyme coagulase. Staphylocoque épiderme ne produit pas de coagulase, et il est généralement moins invasif que Staphylococcus aureus. En fait, c'est un résident normal et commensal de la peau humaine.

Au cours des dernières décennies, cependant, Staphylocoque épiderme est de plus en plus une cause d'infections nosocomiales multirésistantes. Les patients immunodéprimés, les dispositifs médicaux à demeure et les prothèses implantées chirurgicalement offrent des environnements appropriés pour Staphylocoque épiderme se propager et former des biofilms.

C'est là que le projet a commencé, en collaboration avec le chirurgien orthopédiste Dr Alex McLaren et son membre de l'équipe et bio-ingénieur Dr Ryan McLemore du Banner Good Samaritan Medical Center, Phoenix, ainsi que le Dr Mark Spangehl du Mayo Clinic College of Medicine, Arizona.

Selon la plupart des mesures, les souches résistantes et sensibles aux antibiotiques de Staphylocoque épiderme sont phénotypiquement identiques et représentent donc un défi majeur pour les techniques de séparation analytique traditionnelles. C'est là que la technologie ASU trouve sa place.

Les approches cliniques actuelles pour la détermination de la résistance aux antibiotiques nécessitent souvent deux jours ou plus pour obtenir des résultats. Ils s'appuient généralement sur le traitement des bactéries avec des antibiotiques, puis sur l'observation des schémas de croissance des colonies. Les longs délais d'exécution conduisent à une dépendance accrue aux antimicrobiens à large spectre et conduisent généralement à des résultats sous-optimaux pour les patients (y compris des taux de mortalité accrus).

Les scientifiques du groupe Hayes du département de chimie et de biochimie de l'ASU - qui deviendra bientôt l'École des sciences moléculaires - mettent au point un appareil portable fonctionnant sur batterie qui pourrait fournir des réponses en quelques minutes, au lieu de plusieurs jours.

L'identification a lieu dans un canal microscopiquement petit dans une puce en verre et polymère de silicone. Le microcanal présente des formes en dents de scie qui permettent aux chercheurs de trier et de concentrer les microbes en fonction de leurs propriétés électriques uniques.

Le phénomène qui rend ce travail est appelé diélectrophorèse, qui implique une tension appliquée qui exerce une force sur les bactéries. Cette force agit comme un trieur de pièces, provoquant le piégeage des bactéries à différents points le long du canal. L'endroit où ils s'arrêtent et à quelle tension dépendent de leurs propriétés moléculaires et électriques.

En utilisant cette approche, l'équipe de Hayes, y compris les étudiants diplômés Paul V. Jones et Shannon (Huey) Hilton, a séparé des bactéries extrêmement similaires - des bactéries résistantes et sensibles à la gentamicine (antibiotique). Leurs résultats ont récemment été publiés dans la revue Analyste.

"L'important pour le patient et le médecin est d'obtenir la bonne réponse immédiatement. En faisant progresser un domaine scientifique fondamental, nous sommes en mesure de créer une toute nouvelle façon de différencier ces micro-organismes", a déclaré Hayes.

"Et il s'avère que nous avons un mécanisme de base qui pourrait être intégré aux smartphones et être distribué largement et à moindre coût. Franchement, nous espérions seulement que cette stratégie pourrait fonctionner aussi bien, même si nos calculs théoriques suggèrent qu'elle le pourrait."

Les chercheurs ont marqué par fluorescence les deux souches (chacune avec un colorant différent) de Staphylocoque épiderme afin qu'ils puissent être distingués visuellement pendant le processus de séparation. Ils ont injecté les cellules dans chaque canal et ont simplement appliqué une tension pour entraîner les cellules en aval. Les caractéristiques géométriques du canal façonnent le champ électrique, créant des régions d'intensité différente. Ce champ crée la force diélectrophorétique qui permet à certaines cellules de passer, tout en piégeant d'autres en fonction de leur phénotype.

Cette séparation a des implications potentielles importantes pour les soins de santé, car une détection rapide et précoce améliorera considérablement les résultats thérapeutiques. Les résultats actuels établissent une base pour les séparations biophysiques en tant qu'outil de diagnostic direct, améliorant potentiellement presque tous les critères de mérite pour les diagnostics et la gestion des antibiotiques.


4. L'importance des valeurs MIC dans la pratique clinique

Comme la zone d'inhibition de la croissance bactérienne dans la méthode qualitative, la valeur de la CMI sert de base pour évaluer la catégorie de sensibilité ou de résistance du pathogène à un antibiotique donné. Selon les recommandations de l'EUCAST [39], deux catégories de sensibilité et une catégorie de résistance ont été introduites depuis le 01-01-2019 :

Susceptible (S), schéma posologique standard : il existe une forte probabilité de succès thérapeutique en utilisant un schéma posologique standard de l'agent.

Sensible (I), exposition accrue : il existe une forte probabilité de succès thérapeutique car l'exposition à l'agent est augmentée en ajustant le schéma posologique ou par sa concentration au site d'infection.

Résistant : il existe une forte probabilité d'échec thérapeutique même en cas d'exposition accrue.

Le changement majeur dans l'interprétation clinique des résultats, concerne les souches bactériennes classées fin 2018 comme intermédiaires sensibles aux antibiotiques (I). Ces souches étaient auparavant incluses dans les rapports épidémiologiques comme résistantes. D'un point de vue clinique, la modification de la définition “I” implique un changement significatif dans l'interprétation des résultats.

Les deux, un antibiotique de la nouvelle catégorie de sensibilité –I et un autre de la catégorie -S, contribuent au même degré d'efficacité clinique.

Afin d'obtenir un succès thérapeutique avec la catégorie “I”, des doses élevées de l'antibiotique doivent être utilisées, l'intervalle d'administration doit être réduit ou la voie d'administration doit être modifiée (des perfusions continues ou prolongées doivent être appliquées par exemple). L'option choisie pour augmenter l'exposition dépend du type d'antibiotique et de ses paramètres pharmacocinétiques/pharmacodynamiques (PK/PD) (discutés ci-dessous dans cette revue). Cependant, EUCAST a préparé un tableau avec les règles de dosage prenant en compte le dosage standard pour la catégorie S et les doses élevées pour la nouvelle catégorie I (les doses ont été mises à jour en 2021, version 11.0). Cela facilite la prise de décision en ce qui concerne le dosage ou la méthode d'administration du médicament. Sur la base de nouvelles règles d'interprétation des valeurs de CMI, l'utilisation, par exemple, de fortes doses de ciprofloxacine, c'est-à-dire 0,75 g × 2 orale ou 0,4 g × 3 i.v., peut contribuer à l'éradication de Pseudomonas aeruginosa souche de catégorie de sensibilité I à cet antibiotique (0,001 < CMI < 0,5 mg/L) [40]. Wantia et al. ont montré que la connaissance de nouveaux critères d'interprétation clinique, notamment concernant les souches de catégorie I, chez les professionnels de santé doit être améliorée immédiatement [41]. Une interprétation clinique appropriée entraînera l'inclusion d'antibiotiques de catégorie (I) dans les possibilités thérapeutiques. Par conséquent, il existe un besoin accru de formation des professionnels de la santé sur les nouvelles règles d'interprétation clinique des valeurs CMI.

Pour certains antibiotiques et bactéries, la détermination de la CMI est la seule méthode phénotypique fiable pour évaluer la sensibilité aux médicaments car les méthodes qualitatives ont fourni de faux résultats ( Tableau 3 ) [3,4]. La raison pourrait être une mauvaise pénétration d'un antibiotique dans la gélose, comme cela se produit dans le cas de la polymyxine ou de la daptomycine alternativement, en raison de distinctions impossibles entre les isolats de type sauvage et ceux présentant une résistance aux glycopeptides non médiée par vanA dans Staphylocoque spp. Pour les bactéries anaérobies, de faux résultats peuvent survenir en raison de points de rupture non définis [40,42,43]. En ce qui concerne la daptomycine, il est également difficile d'obtenir une concentration appropriée d'ions calcium dans la gélose, qui sont nécessaires à l'évaluation de la sensibilité bactérienne. Tous les faits mentionnés ci-dessus rendent la méthode de diffusion par disque déconseillée [44].

Tableau 3

Antibiotiques et agents pathogènes pour lesquels la sensibilité ne peut être déterminée que par des méthodes de phénotype quantitatives.

Antibiotique(s)Groupe de bactéries
fosfomycineEntérobactéries sauf E. coli, Staphylocoque spp.
tigécyclineEntérobactéries sauf E. coli, Citrobacter koseri
colistinetous les bâtonnets à Gram négatif
tous les antibiotiquesNeisseria spp., anaérobies
bêta-lactaminespénicilline non sensible Streptococcus pneumoniae
glycopeptides/ lipoglycopeptidesStaphylocoque spp.
dalbavancine, oritavancine Groupe streptocoque : Viridans, A,B,C,G

De plus, contrairement aux méthodes qualitatives, la valeur de la CMI permet d'évaluer le degré de sensibilité ou de résistance à l'antibiotique. Les informations sur le degré de sensibilité ont une grande valeur épidémiologique et clinique, mais elles doivent être correctement interprétées. Les différences dans le degré de sensibilité d'une souche aux antibiotiques ne peuvent pas être évaluées en faisant une comparaison directe des valeurs de CMI obtenues pour de tels antibiotiques, ce qui, malheureusement, est parfois fait. Une telle interprétation conduit à croire à tort que la souche est la plus sensible à l'antibiotique pour lequel la CMI est la plus faible. EUCAST a grandement facilité l'évaluation du degré de sensibilité des micro-organismes aux antibiotiques en introduisant de nouveaux critères d'interprétation des résultats. Ces critères distinguent deux niveaux de sensibilité des souches. Le premier niveau concerne le dosage standard tandis que le deuxième niveau se réfère à des valeurs de CMI plus élevées et nécessite une exposition accrue à l'antibiotique. Bien entendu, l'ampleur de la valeur de la CMI aura un impact sur la probabilité des indices pharmacocinétiques/pharmacodynamiques qui sont cruciaux pour l'efficacité de la thérapie. Il ne faut pas oublier que dans certains cas, des niveaux plus élevés de CMI antibiotique proches des seuils peuvent indiquer un échec thérapeutique, bien que la souche puisse être considérée comme sensible aux doses standard. Cela peut être le premier signal de résistance au médicament. Un tel phénomène a été trouvé, par exemple, dans Salmonella enterica sérovar Typhi (S. Typhi). Les souches avec une CMI ≤ de 0,06 mg/L présentaient une mutation ponctuelle associée à la gyrA gène, ce qui a en outre conduit au développement d'une résistance de cette souche aux fluoroquinolones [42,45]. La relation entre la valeur de la CMI de la souche sensible et l'efficacité du médicament est également décrite lorsque la vancomycine est utilisée dans S. aureus infections. Selon les données de la littérature [46] et les lignes directrices de l'EUCAST [40], une CMI de 2 mg/L pour la vancomycine comporte un risque d'échec thérapeutique bien que la souche soit classée comme sensible conformément au point critique accepté.

Pourquoi le degré de susceptibilité est-il important ? Plus la souche est sensible à l'antibiotique, plus il est probable que sa CMI soit inférieure à l'ECOFF et donc que la souche ne développe aucune sous-population résistante aux médicaments, il n'y a donc pas de risque accru de survie bactérienne pendant le traitement. De plus, la sensibilité élevée de la souche augmente les chances d'atteindre la concentration thérapeutique de l'antibiotique et d'éradiquer efficacement l'agent pathogène en utilisant la posologie standard, même chez les patients présentant des modifications significatives des paramètres pharmacocinétiques. La connaissance du degré de sensibilité des souches aux différents antibiotiques utilisés à l'hôpital peut également être un outil utilisé dans la gestion des antibiotiques [47,48,49,50]. Ainsi, les antibiotiques dont la valeur MIC pour la plupart des souches (MIC90) est proche du point d'arrêt pourrait être transféré à un groupe de médicaments avec un accès limité à la thérapie empirique, à moins bien sûr qu'il existe d'autres facteurs en faveur de l'utilisation d'un tel antibiotique. Cela pourrait contribuer à réduire la sélection de souches résistantes aux antibiotiques, même si cela devrait être confirmé par les résultats d'études difficiles à réaliser. Il est pratiquement impossible d'obtenir des données sur la distribution des valeurs de CMI des antibiotiques dans la plupart des hôpitaux, car les valeurs réelles de la CMI (et non les valeurs approximatives de la CMI proposées par les systèmes automatisés tels que VITEK ou Phoenix) ne sont pas déterminées en routine et si elles sont , ils sont effectués pour des antibiotiques sélectionnés uniquement. Ainsi, il n'y a généralement pas de données cumulatives sur la distribution des valeurs de CMI pour les agents pathogènes dominants dans des infections spécifiques. Cependant, cela ne signifie pas que l'équipe de gestion des antibiotiques ne peut pas mettre en place, en concertation avec le laboratoire de microbiologie, un programme de suivi du degré de sensibilité à certains antibiotiques dans un hôpital donné, en particulier dans les unités où, malgré la sensibilité aux antibiotiques de la souche , les échecs thérapeutiques sont plus fréquents. Les données obtenues pourraient servir de base pour évaluer si la liste des antibiotiques dédiés à la thérapie empirique et les schémas posologiques adoptés sont adaptés au degré de sensibilité des souches. Sur la base de ces données cumulatives, Kuti et al. ont introduit des perfusions prolongées de méropénem et des perfusions continues de céfépime dans une unité de soins intensifs pour atteindre une efficacité compte tenu des valeurs élevées de CMI de ces antibiotiques [47]. De plus, en établissant des valeurs de CMI dans la plage de 1,5 mg/L pour la plupart des souches de SARM, ils ont permis d'introduire le linézolide dans le traitement si un traitement de trois jours à la vancomycine à haute dose n'améliorait pas les résultats cliniques du patient. Après 12 mois, cette procédure a contribué à réduire la mortalité de 21,6 % à 8,5 % et la durée d'hospitalisation de 23 jours à 10,5 jours [47]. L'introduction de telles solutions simplement en les transférant d'autres hôpitaux sans aucune référence à la situation épidémiologique locale est injustifiée et ne produira pas les résultats escomptés.

L'utilisation d'antibiotiques à faible CMI pendant le traitement des infections peut améliorer l'efficacité du traitement. Cependant, il faut tenir compte du fait que dans certains cas, même lorsqu'un dosage correct est appliqué, l'éradication des agents pathogènes ne sera pas réalisée. Il peut y avoir diverses raisons à une telle condition, y compris la résistance hétérogène aux antibiotiques (hétérorésistance), la tolérance ou la persistance de micro-organismes dans l'environnement de certains antibiotiques. Chacun de ces phénomènes est différent de la résistance aux antibiotiques communément décrite. La résistance bactérienne typique se manifeste dans de nombreux mécanismes provenant d'une mutation génétique stable ou à la suite de l'expression de gènes de résistance acquis, par une population cellulaire entière. L'hétérorésistance désigne la résistance d'une très petite sous-population de cellules, qui commence à croître rapidement en présence d'un antibiotique tandis que la population vulnérable est tuée. L'arrêt des antibiotiques réduit la réplication d'une sous-population résistante [51]. La détection de cellules résistantes dans les tests n'est généralement pas possible en raison de la faible fréquence de leur apparition dans la population, ce qui peut conduire à des conclusions erronées sur la sensibilité aux antibiotiques. Parfois, une telle sous-population hétérogène peut être observée dans les tests de gradient comme la présence de colonies bactériennes dans une zone d'inhibition de la croissance. La détection de telles souches nécessite généralement une analyse du profil de la population, ce qui n'est pas effectué en routine. Une hétérorésistance a été décrite pour les bactéries, telles que S. aureus, Klebsiella claceae (Auparavant Enterobacter cloacee), Klebsiella pneumoniae, E. coli, P. aeruginosa, Accinetobacter spp., et dans de nombreux antibiotiques, notamment la colistine, la fosfomycine ou encore les carbapénèmes. La difficile détection de l'hétérorésistance à la colistine, l'un des derniers antibiotiques actifs contre les bactéries Gram-négatives résistantes, a conduit à une mise à jour des recommandations. Il est conseillé d'administrer correctement Il est conseillé d'administrer une première dose de charge correctement ajustée de colistine et de l'utiliser fréquemment en association avec d'autres antibiotiques [52]. De plus, Fernandez et. Al. ont rapporté entre 20�% de souches avec une sous-population hétérorésistante à l'imipénème et au méropénème [53]. Il ne s'agit pas seulement d'un problème diagnostique mais surtout d'une situation clinique qui entraîne jusqu'à 10 % d'échec thérapeutique malgré la sensibilité des souches in vitro [51]. Un autre phénomène est la tolérance, qui signifie la survie de la population entière d'une souche en présence d'une concentration élevée en antibiotique malgré l'absence de cellules résistantes aux antibiotiques. Les bactéries avec une telle tolérance ne se développent pas ou ne se divisent pas mais restent viables. La tolérance peut provenir du génotype et être associée à une mutation qui permet aux bactéries d'éviter l'activité bactéricide de l'antibiotique. Il peut également avoir un caractère phénotypique lorsque l'inhibition ou le retard de croissance est le résultat de mauvaises conditions nutritionnelles. La tolérance s'applique uniquement aux antibiotiques bactéricides. Son activité bactéricide diminue ou disparaît tandis que les propriétés bactériostatiques sont maintenues. Les bactéries tolérantes et ces antibiotiques non tolérants peuvent avoir la même CMI. La souche est considérée comme présentant une tolérance lorsqu'un antibiotique à une concentration 32 fois supérieure à la CMI ne contribue pas à une réduction de 99,9 % du nombre de bactéries utilisées dans le test (Concentration Bactéricide Minimale MBL/MIC > 32 mg/L) [51,54]. La persistance est un autre mécanisme bactérien qui peut contribuer à une thérapie inefficace malgré la sensibilité apparente à la souche. La survie ne concerne qu'une petite sous-population bactérienne (1 %) et repose sur la présence de cellules temporairement inactives ou à division très lente [51,54]. Ces trois phénomènes évoqués ci-dessus sont très difficiles à détecter et peuvent être l'explication de l'inefficacité du traitement. Par la suite, la survie de la population bactérienne malgré la présence d'antibiotiques peut favoriser la propagation des mécanismes de résistance.

La valeur de la CMI est considérée comme ayant la plus grande importance dans l'optimisation de l'antibiothérapie ciblée. À cette fin, cependant, il doit être analysé avec des paramètres pharmacocinétiques (PK) qui décrivent le devenir du médicament dans l'organisme hôte. Les paramètres pharmacocinétiques les plus importants sont : le volume de distribution (Vd), la demi-vie d'élimination (t1/2), la clairance (CL), la concentration maximale (Cmax), la concentration minimale (Cmin) et l'aire sous la courbe (AUC). La valeur de ces paramètres dépend de nombreux facteurs, tels que le poids ou l'âge du patient et du degré de dysfonctionnement des organes, l'apport de fluides, mais elle varie également selon les différents groupes de patients. De plus, les paramètres PK changent avec le temps. Dans le cas des souches résistantes aux antibiotiques, l'identification du mécanisme de résistance bactérienne peut avoir un impact supplémentaire sur la signification de la valeur de la CMI. Ce sujet est particulièrement abordé dans le cas des bactéries Gram-négatives produisant des carbapénémases. Il est bien connu que les carbapénèmes peuvent posséder un spectre et une force d'activité hydrolytique différents contre des bêta-lactamines particulières, y compris les carbapénèmes. Selon EUCAST et CLSI, la détection du mécanisme de résistance n'élimine pas la possibilité d'utiliser les carbapénèmes dans le traitement des infections causées par des bactéries productrices de carbapénèmes. Quel que soit le type de carbapénémase ou de bêta-lactamases à spectre étendu (BLSE) produit, l'interprétation clinique et la classification S, I ou R de la souche doivent être basées sur la valeur de CMI obtenue. Actuellement, le méropénème est considéré comme le carbapénème le plus important, actif contre les Gram-négatifs Entérobactéries. Il fait partie des antibiotiques recommandés pour le traitement des infections causées par les souches CPE, en particulier lorsque la souche est définie comme S (MIC ≤ 2 mg/L, EUCAST BP)). Habituellement, le déclenchement d'une sensibilité totale indique un traitement efficace avec l'utilisation de doses standard d'un médicament, mais dans ce cas, en raison de la détection de la production de carbapénèmes, le méropénème doit être utilisé à fortes doses, c'est-à-dire 2 g toutes les 8 h en perfusions prolongées. Dans une plage de valeurs 2 mg/L < CMI ≤ 8 mg/L (Susceptible (I), exposition augmentée, selon EUCAST v.11.0), le méropénème doit être utilisé non seulement à fortes doses et avec des en perfusion, mais également en association avec des antibiotiques tels que la colistine, la tigécycline ou l'amikacine, en fonction de la sensibilité de l'agent pathogène. Si la valeur de la CMI ne dépasse pas 32 mg/L, il est également autorisé d'utiliser le méropénème en cas de résistance aux carbapénèmes [55]. Avec 8 < CMI ≤ 32 mg/L, il faut non seulement appliquer des doses élevées, mais aussi l'associer à au moins deux autres antibiotiques [56]. Il a été démontré que la thérapie combinée avec le méropénem contribuait à une augmentation de la survie des patients, en particulier avec une CMI de 8 mg/L (16/19 patients atteints d'infections critiques). Il est à noter que vis-à-vis des souches KPC(+), de nouveaux antibiotiques ayant une activité contre des carbapénémases spécifiques doivent être utilisés, tels que la ceftazidime avec l'avibactam ou le méropénem avec le varbobactam. La sélection d'antibiotiques la plus difficile est celle où une résistance panpharmaceutique est identifiée. Ce phénomène est surtout observé dans le cas des souches NDM(+) qui acquièrent d'autres mécanismes de résistance. Dans ce cas, la seule solution est une thérapie combinée avec un minimum de trois médicaments. La CMI des antibiotiques importe-t-elle dans un tel cas ? Les auteurs des International Consensus Guidelines for the Optimal Use of the Polymyxins de 2019 [52] suggèrent de choisir les médicaments présentant le degré de résistance le plus faible, où la valeur de la CMI est la plus proche des points de rupture. Par conséquent, même dans des situations extrêmes, la valeur MIC peut être importante, bien qu'il n'y ait aucune preuve de l'efficacité d'une telle procédure.

La relation quantitative entre la CMI et la PK est déterminée par les indices pharmacocinétiques/pharmacodynamiques PK/PD [57,58,59,60,61,62,63,64]. L'efficacité clinique des différents groupes d'antibiotiques dépend de l'une des trois PK/PD différentes :


DIRECTIONS FUTURES

Dans cette revue, nous avons identifié des critères pour un dispositif efficace capable d'effectuer des tests sur site à haut débit pour détecter les antibiotiques dans l'environnement. Un appareil optimal serait très sensible, capable de multiplexer et de détecter des composés à partir de matrices complexes, et nécessiterait un équipement, une électricité, un temps de procédure et une formation technique minimes pour l'utilisateur. De plus, il serait rentable, aurait une durée de conservation prolongée dans diverses conditions environnementales et respecterait les normes de biosécurité. Comme discuté dans cette revue, il existe maintenant de nombreuses techniques sensibles pour la détection et la quantification des antibiotiques, mais aucune ne satisfait actuellement à tous ces critères. Bien que des obstacles importants subsistent pour adapter l'un des dispositifs existants à une utilisation en première ligne, une mise en œuvre sur site sur le terrain, plusieurs sont prometteurs. La solution la plus pratique en termes de rentabilité, de durée de conservation et de facilité d'utilisation sur le terrain est peut-être une approche basée sur un promoteur bactérien utilisant une bandelette ou une bandelette réactive. Une gamme diversifiée de solutions de type bandelette pour la détection d'antibiotiques a été conçue, couvrant une gamme de sensibilités et de capacités de quantification (Link, Weber et Fussenegger 2007 Fantino, Barras et Denizot 2009 Gomes, Goreti et Sales 2015 Han et al. 2016 Duyen et al. 2017 Wang et al. 2017a). En termes de sortie de l'appareil, un test colorimétrique fournirait une sortie conviviale et facilement lisible qui ne nécessite pas d'équipement coûteux pour la détection ou l'analyse.

La technique de Link, Weber et Fussenegger (2007) intègre bon nombre de ces critères prêts à l'emploi. Intégrant un système de promoteur inductible sans cellule avec un mécanisme rapporteur basé sur des anticorps, cette approche de bandelette sans cellule s'est avérée très sensible, détectant une gamme de classes d'antibiotiques à des concentrations de 2 à 40 ng/mL. Des bandelettes individuelles ont été conçues pour la reconnaissance spécifique de différents antibiotiques, sans aucun signe de diaphonie significative entre les cibles. Enfin, ces jauges ont une durée de conservation allant jusqu'à 6 semaines à température ambiante. La nécessité d'une technique de type jauge, qui est facile à utiliser sur place et fournit une sortie visuelle relativement rapide, est bien justifiée dans la littérature pertinente avec celle de Link et al. cité à plusieurs reprises un modèle d'une telle technique (Adrian et al. 2012 Cháfer-Pericás, Maquieira et Puchades 2010 Chen et al. 2012 Jiang et al. 2013 Diner et al. 2017 Kamakoti et al. 2018). La méthode de la bandelette réactive a été comparée à d'autres tests de biocapteurs et a été remarquée pour sa facilité d'utilisation et sa sensibilité avantageuses pour la détection des antibiotiques dans les échantillons d'aliments (Cháfer-Pericás, Maquieira et Puchades 2010). Un examen récent des orientations futures de la biodétection et de la thérapie médicamenteuse personnalisée a identifié la méthode de la bandelette réactive comme le modèle illustrant le faible coût et la portabilité dans la conception de biocapteurs (Dincer et al. 2017).

Cependant, malgré ses promesses, d'importants problèmes demeurent empêchant sa mise en œuvre sur le terrain. Comparée à d'autres techniques de détection d'antibiotiques, la technique de la bandelette réactive a été critiquée pour son manque de sélectivité (Kim et al. 2010 heures et al. 2013). Bien que le dosage par bandelette réactive puisse distinguer trois classes d'antibiotiques, les tétracyclines, les macrolides et les streptogramines, il manque de spécificité supplémentaire en raison des similitudes structurelles des molécules antibiotiques au sein de ces classes (Link, Weber et Fussenegger 2007). Pour faire la distinction entre les sous-classes d'antibiotiques, par conséquent, un test avec une spécificité plus élevée tel qu'un aptasensor est avantageux. Le dosage de la bandelette réactive a également été critiqué pour la longueur des temps d'incubation requis, nécessitant souvent jusqu'à 1 h (Link, Weber et Fussenegger 2007 Cháfer-Pericás, Maquieira et Puchades 2010).

Cependant, les améliorations apportées au dosage de la bandelette réactive construits par Link et al. ont déjà été publiés (Kling et al. Diner 2016 et al. 2016). Le mécanisme de détection de la jauge a été adapté sur une plate-forme microfluidique pour permettre une détection multiplexée sur un appareil miniaturisé. De plus, la sortie a été modifiée pour produire un signal électrochimique plutôt que colorimétrique, permettant une sortie quantifiable plus précise. Ce biocapteur s'est avéré avoir une durée de conservation robuste allant jusqu'à 3 mois et un temps de sortie rapide de 15 min (Kling et al. 2016). Bien qu'il conserve des limites de spécificité et qu'il n'ait été testé qu'avec du sérum humain enrichi, il offre les avantages supplémentaires d'un temps de protocole plus rapide et d'une capacité de multiplexage. En fin de compte, en tant que technique d'évaluation de première intention sur site, la détection et l'identification plus larges des classes d'antibiotiques ont été jugées suffisantes (Cháfer-Pericás, Maquieira et Puchades 2010 Aga et al. 2016 Kling et al. 2016). De plus, un criblage supplémentaire de promoteurs naturels et la capacité de concevoir des promoteurs synthétiques ont un énorme potentiel pour résoudre les problèmes de spécificité (Goh et al. 2002 Hutter et al. 2004 Mascher et al. 2004 Urbain et al. 2007 Yagur-Kroll, Bilic et Belkin 2010 Staroń, Finkeisen et Mascher 2011 Melamed et al. 2012 Wang, Tang et Yang 2017).


Mécanismes moléculaires de résistance

Les bactéries sont génétiquement codées pour utiliser des mécanismes de résistance intrinsèques ou acquis pour combattre les agents antimicrobiens. Une résistance intrinsèque peut également être observée lorsque l'on compare les niveaux de sensibilité clinique de deux espèces différentes à un médicament commun. Par exemple, la pénicilline G peut avoir une plus grande affinité de liaison pour les protéines de liaison à la pénicilline de Streptococcus agalactiae que pour ceux de Enterococcus faecalis.

Nous savons que la résistance à la méthicilline des S. aureus (SARM) est principalement due aux changements qui se produisent dans la PBP, qui est la protéine à laquelle les antibiotiques ß-lactames se lient et inactivent, pour inhiber la synthèse de la paroi cellulaire. Ce changement est causé par l'expression d'un certain gène mecA dans certaines souches de S. aureus qui surviennent à la suite d'antécédents de pénicilline et d'autres antimicrobiens. L'expression du gène mecA donne une PBP alternative (PBP2a) qui a une faible affinité pour la plupart des antibiotiques ß-lactamines, permettant ainsi à ces souches de se répliquer en présence de méthicilline et d'antibiotiques apparentés.

Une certaine résistance aux antimicrobiens est causée par de multiples changements dans le génome bactérien. Par exemple, la résistance à l'isoniazide de Mycobacterium tuberculosis résulte de modifications des gènes suivants : gène katG qui code pour une catalase, gène inhA qui est la cible de l'isoniazide, les gènes voisins oxyR et aphC et leur région intergénique.

Résistance biologique versus résistance clinique

La résistance biologique fait référence aux changements qui rendent l'organisme moins sensible à un agent antimicrobien particulier. Lorsque la sensibilité aux antimicrobiens a été perdue à un point tel que le médicament n'est plus efficace pour une utilisation clinique, on dit que l'organisme a atteint une résistance clinique. Il est important de noter que la résistance biologique et la résistance clinique ne coïncident pas nécessairement. Du point de vue des laboratoires cliniques et de la santé publique, le développement biologique de la résistance aux antimicrobiens est un processus continu, tandis que la résistance clinique dépend des méthodes de laboratoire actuelles et des seuils établis. Notre incapacité à détecter de manière fiable la résistance biologique avec les procédures et critères de laboratoire actuels ne doit pas être perçue comme une preuve qu'elle ne se produit pas (Forbes, et al., 1998).

Résistance intrinsèque

La résistance intrinsèque est la capacité innée d'une espèce bactérienne à résister à l'activité d'un agent antimicrobien particulier grâce à ses caractéristiques structurelles ou fonctionnelles inhérentes, qui permettent la tolérance d'un médicament ou d'une classe antimicrobienne particulière. Cela peut aussi être appelé « insensibilité » car cela se produit chez des organismes qui n'ont jamais été sensibles à ce médicament particulier.

Une telle insensibilité naturelle peut être due à :

  • manque d'affinité du médicament pour la cible bactérienne.
  • l'inaccessibilité du médicament dans la cellule bactérienne.
  • l'extrusion du médicament par des exportateurs actifs codés par les chromosomes.
  • production innée d'enzymes qui inactivent le médicament.

Exemples de résistance intrinsèque et leurs mécanismes respectifs

(D'après Forbes, et al., 1998, Giguère, et al., 2006).

Incapacité à réduire de manière anaérobie le métronidazole à sa forme active

Biofilms, qui sont une agrégation de cellules bactériennes fermement attachées à une surface via des vrilles ou des filaments, illustrent plusieurs formes de résistance intrinsèque.

  • Ils sont entourés d'une couche protectrice visqueuse d'ADN, de protéines et de polysaccharides qui forme une barrière à la pénétration des antibiotiques.
  • Les charges électriques sur la surface visqueuse empêchent l'entrée de certains médicaments antimicrobiens.
  • La structure tridimensionnelle complexe des biofilms contient des protéines de transport pour l'absorption des nutriments et l'élimination des déchets, ces dernières pouvant pomper les médicaments hors des cellules.
  • Les biofilms ont la capacité de réduire la concentration de certains médicaments antimicrobiens atteignant les cellules bactériennes, les rendant moins efficaces pour désactiver les bactéries.
  • Étant donné que les cellules situées au plus profond d'un biofilm reçoivent moins d'oxygène et moins de nutriments, elles se développent relativement lentement et sont donc moins sensibles à l'action des médicaments antimicrobiens.

Quelques exemples de bactéries capables de former des biofilms qui ont un impact sur les animaux comprennent Neisseria spp. comme la plaque dentaire sur les dents, Staphylocoque intermédiaire sur les implants orthopédiques et les stimulateurs cardiaques, et Salmonelle spp. sur les surfaces environnementales.

Implications cliniques : résistance intrinsèque

La connaissance de la résistance intrinsèque est importante dans la pratique clinique pour éviter les thérapies inappropriées et inefficaces. Pour les agents pathogènes bactériens naturellement insensibles à un grand nombre de classes d'antimicrobiens, tels que Mycobacterium tuberculosis et Pseudomonas aeruginosa, cette considération peut limiter l'éventail des options de traitement et augmenter ainsi le risque de résistance acquise.

Résistance acquise

On dit que la résistance acquise se produit lorsqu'un micro-organisme particulier obtient la capacité de résister à l'activité d'un agent antimicrobien particulier auquel il était auparavant sensible. Cela peut résulter de la mutation de gènes impliqués dans des processus physiologiques et des structures cellulaires normaux, de l'acquisition de gènes de résistance étrangers ou d'une combinaison de ces deux mécanismes. Un changement et/ou un échange génique réussi peut impliquer une mutation ou un transfert horizontal de gène par transformation, transduction ou conjugaison.

Contrairement à la résistance intrinsèque, les traits associés à la résistance acquise ne se trouvent que dans certaines souches ou sous-populations d'une espèce bactérienne et nécessitent des méthodes de laboratoire pour la détection. Ces mêmes méthodes sont utilisées pour surveiller les taux de résistance acquise comme moyen de lutter contre l'émergence et la propagation de traits de résistance acquis chez les espèces bactériennes pathogènes et non pathogènes.

Mécanisme de résistance acquise via le changement ou l'échange de gènes

Les antibiotiques exercent une pression sélective sur les populations bactériennes en tuant les bactéries sensibles, permettant aux souches résistantes à un antibiotique de survivre et de se multiplier. Ces traits sont transmis verticalement aux cellules ensuite reproduites et deviennent des sources de résistance. Étant donné que les traits de résistance ne sont pas nécessairement éliminés ou inversés, la résistance à une variété d'antibiotiques peut s'accumuler au fil du temps. Cela peut conduire à des souches multirésistantes, qui sont plus difficiles à éliminer en raison des options thérapeutiques efficaces limitées.

Dans cette section, nous discuterons de la résistance acquise en ce qui concerne :

  • Mutation
  • Transfert de gènes horizontal
  • Détection de la résistance aux antimicrobiens
    Approches et stratégies de laboratoire
  • Méthodes de test pour détecter la résistance aux antimicrobiens
  • Exemples de méthodes de test de sensibilité aux antibiotiques

Mutation

Image : Un génome bactérien normal entraîne une structure et une fonction cellulaires normales, tandis qu'une mutation dans le génome bactérien entraîne une structure et une fonction cellulaires altérées et, finalement, une sensibilité modifiée.

Une mutation est une modification spontanée de la séquence d'ADN qui peut entraîner une modification du trait pour lequel elle est codée. Tout changement dans une seule paire de bases peut entraîner un changement correspondant dans un ou plusieurs des acides aminés correspondants, ce qui peut alors changer la structure de l'enzyme ou de la cellule et par conséquent affecter l'affinité ou l'activité d'efficacité des antimicrobiens apparentés.

Dans les génomes procaryotes, des mutations se produisent fréquemment en raison de changements de base causés par des agents exogènes, des erreurs d'ADN polymérase, des délétions, des insertions et des duplications (Gillespie, 2002).

Transfert de gènes horizontal

Le transfert horizontal de gènes, ou le processus d'échange de matériel génétique entre bactéries voisines, est un autre moyen par lequel la résistance peut être acquise. De nombreux gènes de résistance aux antibiotiques sont portés par des plasmides, des transposons ou des intégrons qui agissent comme des vecteurs pour transférer des gènes à d'autres espèces bactériennes similaires. Le transfert horizontal de gènes peut se produire via trois mécanismes principaux : la transformation, la transduction ou la conjugaison.

Mécanismes d'échange de gènes : conjugaison

Échange de gènes par conjugaison impliquant un transfert de plasmide

La transformation implique le processus par lequel les bactéries absorbent de courts fragments d'ADN. La transduction implique le transfert d'ADN d'une bactérie à une autre via des bactériophages. La conjugaison implique le transfert d'ADN via le pilus sexuel et nécessite un contact de cellule à cellule. Regardez une courte vidéo sur le transfert horizontal de gènes.

Le saviez-vous? La conjugaison a été décrite pour la première fois en 1946 par Lederberg et Tatum, sur la base d'études montrant que les bactéries intestinales E. coli utiliser un processus ressemblant au sexe pour échanger des éléments circulaires extrachromosomiques, maintenant connus sous le nom de plasmides. (Torrence et Isaacson, 2003)

Exemples de résistance acquise par mutations et transfert horizontal de gènes, y compris la résistance observée et le mécanisme impliqué.

Résistance acquise à travers Résistance observée Mécanisme impliqué
Mutation Mycobacterium tuberculosis résistance aux rifamycines Mutations ponctuelles dans la région de liaison à la rifampicine de rpoB
Résistance de nombreux isolats cliniques aux fluoroquinolones Mutation prédominante de la région déterminante de la résistance aux quinolones (QRDR) de GyrA et ParC/GrlA
E. coli, Hemophilius influenzae résistance au triméthoprime Mutations dans le gène chromosomique spécifiant la dihydrofolate réductase
Transfert horizontal de gènes Résistance de Staphylococcus aureus à la méthicilline (SARM) Via l'acquisition de gènes mecA qui se trouvent sur un élément génétique mobile appelé « chromosome de cassette staphylococcique » (SCCmec) qui code pour les protéines de liaison à la pénicilline (PBP) qui ne sont pas sensibles à l'inhibition des -lactamines
Résistance de nombreuses bactéries pathogènes aux sulfamides Induit par le transfert horizontal de gènes folP étrangers ou de parties de celui-ci
Enterococcus faecium et E. faecalis résistance à la vancomycine Via l'acquisition de l'un des deux groupes de gènes apparentés VanA et VanB, qui codent pour des enzymes qui modifient le précurseur du peptidoglycane, réduisant l'affinité pour la vancomycine

Détection de la résistance aux antimicrobiens

Historiquement, les vétérinaires praticiens prescrivaient des antibiotiques en fonction du mode d'action attendu, du spectre d'activité et de l'expérience clinique. Avec l'émergence et la propagation de la résistance aux antimicrobiens, le traitement des infections bactériennes est devenu de plus en plus difficile et n'est plus aussi simple qu'il l'était de nombreuses années auparavant. Les praticiens doivent maintenant considérer que les organismes traités peuvent être résistants à certains ou à tous les agents antimicrobiens. Ces considérations nécessitent des tests de sensibilité aux antimicrobiens comme procédure standard.

Les méthodes de test de sensibilité aux antimicrobiens sont in vitro procédures utilisées pour détecter la résistance aux antimicrobiens et la sensibilité des isolats bactériens individuels à un large éventail d'options de thérapie antimicrobienne. Ces mêmes méthodes peuvent également être utilisées pour surveiller l'émergence et la propagation de micro-organismes résistants dans la population.

Les seuils cliniques sont des valeurs seuils établies pour chaque combinaison agent pathogène-antibiotique-hôte indiquant à quel niveau d'antibiotique l'isolat est sensible, intermédiaire ou résistant aux schémas thérapeutiques standard recommandés par le fabricant. Les critères d'interprétation pour ceux-ci sont basés sur des études approfondies qui mettent en corrélation les données de résistance en laboratoire avec les niveaux sériques réalisables pour chaque agent antimicrobien et un historique de résultats thérapeutiques réussis et infructueux. Bien que les laboratoires vétérinaires fondaient à l'origine des interprétations sur des normes établies à l'aide d'agents pathogènes humains, il est devenu évident au début des années 1980 qu'une telle approche ne prédisait pas de manière fiable les résultats cliniques lorsqu'elle était appliquée à la pratique vétérinaire. Par la suite, des groupes ont été créés pour élaborer des normes vétérinaires spécifiques.

Normes de publication des organisations

  • États-Unis : Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI anciennement NCCLS).
  • Union européenne : Comité européen sur les tests de sensibilité aux antimicrobiens (EUCAST).
  • Union européenne : Office International des Épizooties (OIE).
  • Royaume-Uni : Société britannique de chimiothérapie antimicrobienne.
  • Allemagne : Deutsches Institut für Normung.
  • France : Société Française de Microbiologie.
  • Suède : Groupe suédois de référence pour les antibiotiques.
  • Australie : méthode de diffusion sur disque CDS.

MÉTHODES

Dosages microbiologiques

Une méthode classique pour détecter la présence d'antibiotiques est l'utilisation de tests microbiologiques qui emploient des espèces de bactéries sensibles aux antibiotiques pour déterminer si des antibiotiques spécifiques sont présents dans un échantillon donné et, avec une sensibilité limitée, leur concentration. Depuis les années 1950, les tests microbiologiques ont identifié des aberrations dans les schémas de croissance connus pour détecter la présence d'antibiotiques dans un échantillon donné (Kersey et al. 1954). Les tests commerciaux actuels reposent sur l'une des deux techniques pour identifier la présence d'antibiotiques dans un échantillon. La diffusion sur disque utilise des disques recouverts de l'échantillon d'intérêt qui sont placés sur des plaques sur lesquelles des bactéries sont cultivées. La présence d'un halo de croissance dégagée autour du disque indique que les bactéries ont été tuées par un antibiotique dans le disque. Ce test permet d'identifier des antibiotiques spécifiques ou des classes d'antibiotiques selon les espèces de bactéries utilisées et a été optimisé pour une utilisation dans des échantillons de lait avec une limite de détection (LOD) pour les β-lactamines comprise entre 30 et 80 ng/mL (Kukurova et Hozova 2007 Pièce et al. 2016). Une deuxième technique utilise des bactéries spécifiques avec une sensibilité connue aux antibiotiques qui ont été conçues pour produire une sortie colorimétrique. Ces réactions de changement de couleur peuvent être analysées quantitativement par spectrophotométrie pour déterminer la concentration d'antibiotique présent dans l'échantillon et peuvent être aussi sensibles que 1 ng/mL, mais nécessitent une technique stérile et des installations de laboratoire pour co-incuber l'échantillon avec des bactéries (Le Breton , Savoy-Perroud et Diserens 2007 Kalunke et al. 2018).

En tant que technique standard, les tests microbiologiques disponibles dans le commerce ont été optimisés pour tester des échantillons d'aliments et de boissons, en particulier des échantillons de lait et de sérum, afin de déterminer si des niveaux physiologiquement pertinents d'antibiotiques sont présents (Kukurova et Hozova 2007 Le Breton, Savoy-Perroud et Diserens 2007 Beltrán et al. 2015 Kalunké et al. 2018). D'autres méthodes microbiologiques ont des résultats qualitatifs ou semi-quantitatifs et fournissent soit une réponse binaire soit une plage de concentrations (Kukurova et al. 2007 Le Breton, Savoy-Perroud et Diserens 2007 Kalunke et al. 2018). Ces méthodes sont capables de fonctionner dans des matrices complexes, mais en raison de leur sortie, il serait difficile de déterminer des concentrations précises. De nombreux tests microbiologiques se concentrent exclusivement sur la famille d'antibiotiques β-lactamines, couramment utilisés en médecine vétérinaire, et ont une faible sensibilité en dehors de cette catégorie, un examen des tests commerciaux a révélé que, bien qu'ils puissent détecter des concentrations aussi faibles que 4 ng/mL dans le -famille des lactames, les tests sont limités à 100 ng/mL ou plus dans les autres familles (revue à Beltrán et al. 2015).

Pour certains tests microbiologiques, le besoin d'installations de laboratoire est atténué par la microfluidique et les techniques à base de papier qui fonctionnent de manière fiable avec des échantillons non stériles et dans des conditions de terrain (Sun et al. 2011 Deiss et al. 2014). L'analyse microfluidique repose sur des modifications de la morphologie bactérienne lorsque des concentrations sublétales, mais non subinhibitrices, d'antibiotiques sont présentes dans l'échantillon (Sun et al. 2011). Cette technique nécessite une certaine expertise pour être mise en œuvre mais est prometteuse pour l'adaptation sur le terrain. La microfluidique des gouttelettes présente une plus grande sensibilité, mais les techniques actuelles se sont concentrées sur l'identification de la présence de gènes de résistance aux antibiotiques plutôt que sur la mesure des concentrations d'antibiotiques (Kaminski, Scheler et Garstecki 2016).

En résumé, les tests microbiologiques nécessitent généralement un équipement important et des installations de laboratoire stériles et sont souvent optimisés pour des antibiotiques spécifiques, ce qui les rend relativement mal adaptés aux analyses de terrain sur site, bien que le développement de techniques microfluidiques ou à base de papier ait élargi la gamme de ces tests. dosages. Un défi pour l'utilisation sur le terrain des tests microbiens sur papier est l'exigence de bactéries vivantes ou lyophilisées qui peuvent être reconstituées sur place sans introduire de contamination. En raison de ces préoccupations ainsi que des exigences de portabilité, d'incubation et de stérilité, les tests microbiologiques ne sont actuellement pas optimaux pour les tests sur le terrain.

Essais physiques et chimiques

Contrairement aux tests microbiologiques, qui sont limités par la sensibilité bactérienne aux antibiotiques, les tests physiques et chimiques ciblent des propriétés spécifiques de la molécule telles que la taille, la charge, les caractéristiques de liaison ou les propriétés réactives pour identifier les antibiotiques dans un échantillon diversifié. La purification physique implique la séparation de l'antibiotique des autres impuretés dans l'échantillon pour permettre l'isolement de l'élément souhaité par fractionnement répété. La fraction finale pour la purification des antibiotiques est analysée par spectrophotométrie et a une LOD d'environ 25 ng/mL (revue dans González de la Huebra et Vincent 2005).

L'échantillon préparé peut en outre être analysé à l'aide de la spectrométrie, une capacité à forte intensité d'équipement sensible jusqu'à une résolution d'une seule molécule. La spectrométrie de masse en tandem analyse les échantillons pour les molécules d'intérêt, y compris les antibiotiques, avec une LOD inférieure à 0,1 ng/mL (Zhang et al. 2013). La chromatographie liquide/spectrométrie de masse (LC/MS) a été adaptée pour quantifier les concentrations d'antibiotiques dans les échantillons de lait, de sérum, de viande, de sol et d'eau (Luo et al. 2010 Hoa et al. 2011 Zhang et al. 2013 Bayen et al. 2014 Kostich, Batt et Lazorchak 2014 Tang et al. 2015 Jah et al. 2017). La LC/MS a également été mise en œuvre pour analyser des échantillons de terrain, où les effets de matrice ont été jugés insignifiants après purification (Luo et al. 2010 Hoa et al. 2011 Zhang et al. 2013 Kostich, Batt et Lazorchak 2014 Tang et al. 2015 Jah et al. 2017). Certaines techniques couramment utilisées pour lutter contre les complications des matrices de sol sont la dilution isotopique, l'ajout d'étalon, l'étalonnage manuel ou le changement de colonne (Aga et al. 2005 Bayen et al. 2014). Les techniques physiques ont été optimisées avec succès pour les échantillons environnementaux, indiquant qu'elles ne nécessitent pas d'intrants stériles et sont un excellent outil pour l'analyse en laboratoire (Luo et al. 2010 Bayen et al. 2014 Chen et Zhou 2014 Kostich, Batt et Lazorchak 2014 Begou et al. 2017). Cependant, la purification et la spectrométrie nécessitent un degré important d'expertise de l'utilisateur et une infrastructure de soutien et impliquent des procédures difficiles ou une technologie sensible difficilement transportable sur les sites de terrain. Cette technique est la mieux adaptée pour traiter des échantillons de terrain dans des laboratoires entièrement équipés (Soprani et al. 2016 Pan et Chu 2017).

Alternativement, la spectroscopie Raman améliorée en surface (SERS) permet d'utiliser des électrodes sérigraphiées pour l'analyse spectroscopique. Cette technique offre une haute sensibilité et une détection portable et rapide qui peut être facilement adaptée au travail sur le terrain (Li et al. 2014). Avec une durée de procédure de moins de 10 min, SERS a été utilisé pour déterminer les concentrations d'antibiotiques dans les échantillons d'eau (Li et al. 2013). Cependant, le SERS nécessite également une purification de l'échantillon pour enrichir les antibiotiques par rapport à d'autres polluants ou solutés dans l'échantillon, augmentant ainsi les connaissances techniques nécessaires pour tester sur site. L'élimination du pré-traitement de l'échantillon et l'automatisation de l'analyse des données de sortie pourraient optimiser le SERS pour une utilisation sur site.

Les analyses chimiques prêtes à l'emploi ont exploité la microfluidique ou les approches papier pour être à la fois portables et évolutives. Un groupe a conçu un système microfluidique qui permet une interaction chimique entre les antibiotiques aminoglycosides et les ions cuivre, avec une sortie chimiluminescente mesurable, cette méthode sur puce est portable et a une LOD inférieure à 1 ng/mL (Sierra-Rodero, Fernández-Romero et Gómez-Hens 2012). Bien que ces fonctionnalités soient prometteuses pour une utilisation sur site, cette méthode nécessite une certaine expertise de l'utilisateur pour micro-injecter l'échantillon sur la puce. Les solutions chimiques à base de papier, dans lesquelles les modifications chimiques du papier induisent des résultats colorimétriques en réponse à la présence d'antibiotiques, sont également prometteuses pour le travail sur le terrain et nécessitent moins d'expertise technique. Gomes, Goreti et Sales (2015) ont démontré qu'en ajoutant une couche d'amine sensible aux ions métalliques à un support à base de papier, les oxytétracyclines pouvaient être détectées dans l'eau avec une LOD d'environ 30 ng/mL. Cependant, les méthodes sur papier ne peuvent actuellement détecter que quelques composés d'intérêt prédéterminés. D'autres recherches devraient élargir la capacité des techniques basées sur le papier à identifier une gamme plus large de composés en un seul test.

Immunoessais

Les dosages immunologiques fournissent une détection hautement sensible et spécifique des antibiotiques dans des échantillons liquides complexes ou solides traités, en s'appuyant sur la spécificité des interactions entre les anticorps et la molécule d'intérêt (examiné dans Ahmed et al. 2017). Les dosages immunologiques sont généralement colorimétriques en sortie (Aga et al. 2005 Cháfer-Pericás, Maquieira et Puchades 2010 Graham et al. 2011) mais certains ont des sorties fluorescentes ou chimiluminescentes (Meyer et al. 2016), en fonction de la molécule rapporteur utilisée.

Les immunoessais pour la détection des antibiotiques, en particulier les ELISA, ont été adaptés pour les échantillons de sol, de nourriture et d'eau (Aga et al. 2005 Cháfer-Pericás, Maquieira et Puchades 2010 Graham et al. 2011 Garg et al. 2016 Meyer et al. 2016). En outre, des ELISA disponibles dans le commerce et développés pour des échantillons d'aliments ont été utilisés dans des études de terrain surveillant les eaux usées des rivières et des échantillons de sol prélevés sur des parcelles expérimentales traitées avec du fumier (Aga et al. 2005 et Graham et al. 2011). En raison de la réactivité croisée des anticorps détectant les isomères et les produits de dégradation, les ELISA peuvent surestimer les concentrations et ne pas montrer de déclin dans le temps (Aga et al. 2005). Les immunoessais peuvent fournir une détection sensible des antibiotiques dans les échantillons en utilisant des anticorps secondaires pour amplifier le signal, et ont généralement une LOD inférieure à 1 ng/mL (examiné dans Cháfer-Pericás, Maquieira et Puchades 2010). Cependant, l'ajout d'anticorps secondaires augmente le coût par échantillon, limitant l'utilité des tests immunologiques en tant que technique peu coûteuse et prête à l'emploi. Un autre défi limitant l'utilisation des immunoessais pour l'analyse sur site est leur recours aux spectrophotomètres pour quantifier les résultats des tests. Ces tests nécessitent en outre un niveau modéré d'expertise scientifique pour mener à bien la procédure, empêchant les utilisateurs non formés de participer au processus de collecte de données.

L'utilisation d'anticorps restreint généralement un immunodosage à un seul ou relativement peu d'antibiotiques en fonction de la spécificité des anticorps utilisés dans le dosage (Graham et al. 2011). La réactivité croisée des anticorps diminue la spécificité du test, car les anticorps peuvent réagir avec des composants non biologiquement actifs des voies de dégradation des antibiotiques (Aga et al. 2005). Les mesures de concentration à partir d'un dosage immunologique à réaction croisée surestimeraient le niveau d'antibiotique présent dans un échantillon donné et entraveraient les efforts visant à comprendre la résistance aux antibiotiques dans un contexte écologique.

Malgré ces limitations, les développements récents de dosages immunologiques miniaturisés et conviviaux offrent un certain potentiel pour l'adaptation de cette technique sur le terrain. Un large éventail de techniques a été développé pour adapter les immunoessais dans un format multiplex, améliorant ainsi l'efficacité et la capacité de détection à haut débit en localisant différents anticorps dans des parties distinctes d'une puce ou d'une bande (Jiang et al. 2013 Chanson et al. 2015 Han et al. 2016 Wang et al. 2017a). Un groupe a créé une puce à ADN régénérable et chimiluminescente qui permet de détecter jusqu'à 13 antibiotiques à la fois dans des échantillons de lait et vise à faire évoluer le produit pour une utilisation à faible coût sur le terrain (Meyer et al. 2016). D'autres nouveaux dosages immunologiques ont encore amélioré la convivialité en offrant un dosage multiplex avec une sortie colorimétrique quantifiable. En 2013, Jiang et ses collègues ont développé un test « double colorimétrique » qui utilisait deux systèmes de substrats enzymatiques différents pour détecter simultanément 13 fluoroquinolones et 22 antibiotiques sulfamides (Jiang et al. 2013). Plus récemment, un test multiplex a été créé par Han et al. (2016) qui a permis la détection simultanée de trois antibiotiques différents sur un format de bandelette réactive, cette technique offre plusieurs fonctionnalités qui améliorent la convivialité, notamment une sortie colorimétrique quantifiable et une durée de procédure de 10 minutes sans prétraitement requis pour le dispositif. Dans un appareil similaire, spécialement conçu pour les mesures sur site à haut débit, des billes de latex ont été utilisées pour la sortie colorimétrique sur un test multiplex à bande unique pour trois classes d'antibiotiques. Lorsqu'elle a été testée sur des échantillons de lait enrichis, cette méthode a démontré une sensibilité de 0,3 à 10 ng/mL, avec une diaphonie négligeable entre les classes d'antibiotiques et une durée de procédure de 10 min (Wang et al. 2017a). Ces immunoessais multiplexés, spécialement conçus pour une détection sur site à haut débit, sont prometteurs pour une utilisation de première intention sur le terrain.

Aptacapteurs

Une technique plus récente de détection d'antibiotiques utilise des capteurs aptamères (aptasensors). Les aptamères sont des oligonucléotides d'ADN ou d'ARN qui peuvent se lier avec une grande affinité à des cibles spécifiques (Yang et al. 2017). Les aptasensors développés pour la détection d'antibiotiques se répartissent en trois catégories : électriques, fluorescents et colorimétriques.

Les aptacapteurs électriques immobilisent généralement un aptamère sur la surface d'une électrode ou d'une nanoparticule de telle sorte que l'introduction de la molécule cible provoque un changement de conformation dans l'aptamère. Ce changement libère une sonde ou expose l'électrode à une sonde redox. Abnous et al. a conçu un aptacapteur électrique pour les fluoroquinolones qui est représentatif de la technique à base d'électrodes : un aptamère spécifique à une cible a été immobilisé sur une électrode en or. En l'absence de la cible, les protéines de liaison simple brin (SSB) se sont liées à l'aptamère et ont inhibé l'accès d'une sonde redox à la surface de l'électrode. En présence de la cible, la liaison spécifique à l'aptamère a diminué l'affinité de liaison des SSB, augmentant l'accès à la sonde redox et induisant un décalage détectable du courant avec une sensibilité de 0,0871 ng/mL (Abnous et al. 2017). D'autres aptacapteurs électriques utilisent des matériaux différents pour l'électrode (Li et al. 2017 Wang et al. 2018), ADN simple brin complémentaire pour bloquer une sonde redox (Danesh et al. 2016 Taghdisi et al. 2016) ou différentes sondes telles que des ions ou des points quantiques (Li et al. 2016 Yann et al. 2016), mais obtenir la même sortie avec une sensibilité comparable (Liu et al. 2017a, b).

D'autres aptacapteurs électriques utilisent des nanoparticules comme sonde de signal (Chen et al. 2017b) ou pour immobiliser l'aptamère (Chen et al. 2017a). Chen et al. ont conçu un aptasensor où des aptamères spécifiques de la kanamycine et du chloramphénicol ont été immobilisés sur des billes magnétiques modifiées par un groupe amino et liés de manière complémentaire à des sondes de signal d'ADN avec un cadre organique métallique à l'échelle nanométrique (NMOF) portant un ion spécifique. Lorsque la cible a été introduite, elle s'est liée à l'aptamère, remplaçant et libérant la sonde de signal et générant un courant d'ions détectable dans le NMOF (Chen et al. 2017b).

Les aptacapteurs fluorescents et colorimétriques utilisent un large éventail de mécanismes. L'introduction de la cible provoque un changement de conformation qui peut exposer une surface de nanoparticules à un réactif de changement de couleur (Emrani et al. 2016 Lavaee et al. 2017). Lavaee et al. ADNsb complémentaire immobilisé à la surface de nanoparticules d'or qui, en l'absence de la cible, forment des arcs avec des aptamères spécifiques de la ciprofloxacine, bloquant la surface de la nanoparticule et inhibant la réduction du 4-nitrophénol, et donc le changement de couleur. En présence de la cible, la surface est exposée, réduisant le 4-nitrophénol et provoquant un changement mesurable d'absorbance (Lavaee et al. 2017). La présence de la cible peut également désassembler un complexe complémentaire, libérant ou étouffant un fluorophore (Emrani et al. 2016 Babaei et al. 2017 He, Li et Hu 2017 Ha et al. 2017 Wu et al. 2017 Chen et al. 2017d). Chen et al. utilisé l'appariement de bases Waston-Crick et Hoogsten pour former une triple hélice entre deux bras flanquant un aptamère spécifique de la tétracycline et une sonde de transduction de signal (STP), qui, en présence de la cible, désassemble et libère la STP. Le STP forme alors un quadruplex et se lie à la thioflavine T, générant une sortie fluorescente (Chen et al. 2017d). D'autres aptacapteurs fluorescents et colorimétriques peuvent utiliser des boucles en épingle à cheveux qui forment un quadruplex en présence de la cible (Cui et al. 2018) ou une exonucléase pour amplifier un signal (He, Li et Hu 2017 Wu et al. 2017). Les aptasensors peuvent également former des boucles en épingle à cheveux qui peuvent ensuite être détectées par qRT-PCR (Duan et al. 2017) ou électrophorèse sur micropuce (Wang et al. 2017b).

Les aptacapteurs à base de papier ont été conçus pour faciliter le transport des aptasensors. Zhang, Zuo et Ye (2015) présentent un dispositif microfluidique sur papier incorporant des aptamères ADNsb pour la détection d'antibiotiques aminosides, avec une sensibilité d'environ 300 ng/mL, tandis que Sharma et al. (2017) ont conçu une électrode sérigraphiée qui détecte la kanamycine avec une sensibilité de 0,11 ng/mL. Les aptasensors sont très sensibles et ont une LOD de l'ordre du microgramme au nanogramme par litre. Les aptacapteurs les plus sensibles ont tendance à être électriques et peuvent avoir une LOD de 1,07 e à 5 ng/mL (Chen et al. 2017a, b), ce qui est idéal pour détecter des traces d'antibiotiques sur le terrain. De plus, les aptacapteurs ont des procédures relativement courtes, allant de 30 min à 2 h, ce qui est utile pour prélever plusieurs échantillons sur le terrain (Zhang, Zuo et Ye 2015 Li et al. 2016 Yang et al. 2017). Adaptés pour tester les concentrations d'antibiotiques dans des échantillons de lait, de sérum et d'eau, les aptasensors sont capables de détecter efficacement les antibiotiques dans des matrices complexes (Hoa et al. 2011).

Une limitation importante pour l'application des aptasensors sur le terrain est qu'ils sont généralement singleplex et donc incapables d'identifier plusieurs classes d'antibiotiques simultanément. Bien que des aptacapteurs multiplex aient été décrits, la plupart n'ont testé que la détection simultanée d'un maximum de deux antibiotiques (Yan et al. 2016 Chen et al. 2017a, b Huang et al. 2018 Li et al. 2018 Zhou et al. 2018). En 2016, Hao et ses collègues ont mis en œuvre un système d'aptamère d'ADNc avec sortie chimiluminescente pour détecter simultanément l'oxytétracycline, la tétracycline et la kanamycine à une sensibilité de 0,05 ng/mL dans des échantillons de lait. Bien que cette méthode ait été conçue pour être utilisable et démontre une sensibilité élevée, la sortie chimiluminescente peut être une limitation pour une utilisation sur le terrain en raison du besoin d'équipement de détection (Hao, Gu et Duan 2016).

Les aptasensors fournissent une méthode de détection très sensible, relativement rapide et robuste, cependant, ils ont des limitations significatives dans leur capacité à tester une large gamme d'antibiotiques simultanément. De plus, les aptacapteurs nécessitent actuellement une formation importante et des réactifs et équipements de détection. Bien qu'il existe des modèles portables de spectrophotomètres et de postes de travail électrochimiques, ils peuvent être difficiles à utiliser dans des endroits isolés et à faibles ressources. Les aptasensors seraient une méthode de détection secondaire appropriée pour vérifier les résultats avec une sélectivité et une spécificité plus élevées, mais ne sont pas idéaux pour une détection généralisée à haut débit. Cependant, le développement d'aptacapteurs sans réactif ou sans étiquette qui minimiseraient la formation et nécessiteraient moins de ressources est une direction prometteuse pour une utilisation sur le terrain (Yang et al. 2017 Wang et al. 2017b Chen et al. 2017d).

Biocapteurs à cellules entières

Une autre méthode de détection d'antibiotiques utilise la biologie synthétique pour exploiter la machinerie interne des cellules bactériennes afin de déterminer les concentrations locales d'antibiotiques. Plutôt que de simplement surveiller la réponse d'une cellule à la présence d'antibiotiques, les cellules bactériennes peuvent être génétiquement modifiées pour répondre de manière prévisible à différentes concentrations d'antibiotiques. Ceci peut être accompli en insérant des constructions plasmidiques modifiées contenant des séquences d'ADN sensibles aux antibiotiques dans des organismes bactériens hôtes. Le produit est connu sous le nom de biocapteur à cellules entières (Korpela et al. 1998 Gui et al. 2017 Chen et al. 2017c). L'évolution a efficacement amorcé les bactéries pour répondre aux dommages potentiels. Cette réponse est souvent un changement dans l'expression des gènes entraîné par des promoteurs bactériens, induit par la présence d'une petite molécule, y compris des antibiotiques (Goh et al. 2002). Cette réponse cellulaire intrinsèque à la présence d'antibiotiques peut être détectée en fusionnant le promoteur sensible aux antibiotiques à une construction rapporteur qui transduit le signal en une réponse visuelle détectable par l'utilisateur (Chen et al. 2017c).

La construction de biocapteurs bactériens à cellules entières pour la détection d'antibiotiques n'est pas un nouveau concept. En 1998, Korpela et ses collègues ont génétiquement modifié une souche de Escherichia coli en combinant des éléments génétiques sensibles à la tétracycline avec un opéron luciférase, créant un biocapteur qui répond à la tétracycline par bioluminescence (Korpela et al. 1998). Depuis lors, des dizaines d'itérations de conceptions similaires ont été testées et améliorées. Le choix du promoteur est peut-être l'aspect le plus vital de la conception d'un biocapteur, car ce choix détermine la spécificité ainsi que la sensibilité du capteur (Gui et al. 2017). Goh et ses collègues ont découvert qu'après avoir criblé une bibliothèque de 6 500 promoteurs bactériens natifs de Salmonelle typhimurium, jusqu'à 5 % de ces promoteurs ont démontré un changement d'expression en réponse à des concentrations d'antibiotiques sous-inhibitrices. De nombreux promoteurs de ce type ont été bien caractérisés dans un éventail d'espèces bactériennes, fournissant des centaines de cibles potentielles de biocapteurs et d'hôtes bactériens. De plus, en utilisant un panel de fusions promoteur-rapporteur, il permet la classification d'antibiotiques inconnus en fonction de la réponse de chaque promoteur (Goh et al. 2002 Hutter et al. 2004 Mascher et al. 2004 Urbain et al. 2007 Staroń, Finkeisen et Mascher 2011 Melamed et al. 2012).

Les biocapteurs bactériens à cellules entières offrent plusieurs avantages par rapport aux autres techniques de détection. Les bactéries nécessitent relativement peu de ressources à faible coût pour rester viables, et leur réplication rapide rend les tests à haut débit facilement réalisables. De plus, les capteurs bactériens fournissent des informations sur la biodisponibilité des substrats qui, dans le cadre du suivi du développement de la résistance bactérienne, peuvent offrir une métrique plus pertinente que la mesure directe des concentrations dans des échantillons d'eau ou de sol (Aga et al. 2016 Gui et al. 2017).

Les biocapteurs ont été adaptés pour les échantillons de lait, d'eau, de sérum et de viande (Link, Weber et Fussenegger 2007 Pikkemaat et al. 2010 Roda et al. 2011 Zhang, Zuo et Ye 2015 Duyen et al. 2017 Chen et al. 2017c Suárez et al. 2009) et ont également été mis en œuvre dans des études de terrain pour détecter les antibiotiques (Chen et al. 2017c). Alors que les biocapteurs avec des sorties binaires qualitatives fonctionnent de manière cohérente dans des échantillons enrichis (Duyen et al. 2017), des biocapteurs plus quantitatifs ont montré des récupérations de 95 à 101 % et des résultats cohérents avec HPLC et LC/MS (Pikkemaat et al. 2010 Zhang, Zuo et Ye 2015 Chen et al. 2017c). La plupart des techniques traditionnelles de biocapteurs pour la détection d'antibiotiques se sont appuyées sur une sortie fluorescente ou bioluminescente comme mesure des concentrations locales d'antibiotiques, en utilisant des lecteurs de plaques ou des luminomètres pour déterminer les niveaux de sortie (Korpela et al. 1998 Kurittu, Karp et Korpela 2000 Bahl, Hansen et Sørenson 2005 Eltzov et al. 2008 Pikkemaat et al. 2010). Cependant, le seuil de détection de la sortie fluorescente des biocapteurs reste un défi. Pour résoudre ce problème, Melamed et ses collègues présentent une méthode innovante de détection et d'identification de différents types d'antibiotiques. Ils fournissent un panel de 12 souches bactériennes rapporteurs optimisées pour une sortie fluorescente très sensible, associée à un algorithme de calcul qui analyse les courbes dose-réponse pour chaque reporter fluorescente en réponse à un antibiotique inconnu et identifie le type d'antibiotique en fonction de son mode d'action (Melamed et al. 2012 Melamed, Naftaly et Belkin 2014).

Bien que ces méthodes analytiques puissent améliorer l'identification des antibiotiques à partir de la sortie du biocapteur, la fluorescence et la bioluminescence restent difficiles à évaluer avec précision sur le terrain. Pour résoudre ce problème, des biocapteurs ont été construits avec une sortie colorimétrique qui peut être évaluée qualitativement à l'œil nu ou évaluée quantitativement avec un appareil photo numérique et un logiciel d'analyse d'images en ligne (Fantino, Barras et Denizot 2009 Duyen et al. 2017). Bien que ces solutions soient encore limitées dans leur sensibilité quantitative, leur conception est prometteuse pour une applicabilité sur le terrain.

Un autre obstacle à la mise en œuvre sur le terrain est la portabilité des biocapteurs bactériens en dehors du laboratoire. Étant donné que ces biocapteurs reposent sur des bactéries saines, le fonctionnement de nombreux biocapteurs existants est optimal à 37°C et nécessite donc un incubateur. Les développements récents de l'immobilisation cellulaire et des dispositifs miniaturisés ont cependant amélioré les perspectives de stockage des cellules vivantes. Il a été démontré que la lyophilisation (lyophilisation) et la reconstitution ont un effet négligeable sur la fonctionnalité des biocapteurs bactériens (Kurittu, Karp et Korpela 2000). Cette technique a été testée avec succès sur le terrain sans laboratoire pour la détection des tétracyclines (Pikkemaat et al. 2010). Une autre technique de stockage qui tire parti des capacités naturelles de certaines cellules bactériennes est un « sposensor », un dispositif convivial et prêt à l'emploi qui contient des spores bactériennes immobilisées de produits génétiquement modifiés. Bacillus subtilis qui agissent comme des biocapteurs de cellules entières. Bien que testé uniquement sur la bacitracine avec une LOD d'environ 50 ng/mL, il a été conçu spécifiquement pour être facilement utilisable sur le terrain, en utilisant seulement trois tubes et des réactifs limités, et peut donc être un modèle pour de futurs travaux utilisant ces techniques (Fantino, Barras et Denizot 2009).

La sensibilité des biocapteurs à cellules entières reste un obstacle plus difficile en raison des limitations de sensibilité dans la détection de la sortie du biocapteur, plutôt que de la réponse du biocapteur lui-même. Bien que les capteurs colorimétriques offrent une approche qualitative fiable sans équipement, ils ne sont pas idéaux pour une analyse quantitative approfondie. Le domaine de la bio-ingénierie offre une alternative puissante : la biopuce ou la conception « laboratoire sur puce », qui intègre des biocapteurs bioluminescents à cellules entières avec des photomultiplicateurs miniaturisés et des détecteurs à couplage de charge (CCD) pour amplifier et convertir le signal. Cette sortie peut ensuite être analysée avec un logiciel en ligne pour fournir un résultat quantitatif (Roggo et van der Meer 2017). En 2011, Roda et ses collègues ont effectué trois tests bioluminescents différents en mettant en œuvre l'imagerie CCD sur un dispositif miniaturisé avec des cellules bactériennes et de levure modifiées. Bien qu'ils n'aient pas tenté de détecter des composés antibiotiques à l'aide de leur appareil, le succès de trois tests différents suggère que cette technique pourrait être adaptée à la détection d'antibiotiques en utilisant différentes souches bactériennes modifiées. Cette technique s'est avérée avoir une durée de conservation robuste pouvant aller jusqu'à 35 jours avec réfrigération, ce qui la rend appropriée pour le transport et l'utilisation sur le terrain (Roda et al. 2011).

Alors que les biopuces subissent des améliorations rapides en termes de taille et de facilité d'utilisation, la solution de terrain la plus rentable est à base de papier. Les biocapteurs à cellules entières colorimétriques sur papier, y compris le « sporosensor », ont démontré une conception innovante et une fonctionnalité et une facilité d'utilisation prometteuses, mais fonctionnent toujours mieux à 37 °C car ils utilisent des cellules bactériennes vivantes (Fantino, Barras et Denizot 2009). Comme alternative, des systèmes sans cellules peuvent être utilisés qui utilisent la même machinerie cellulaire qu'un biocapteur typique, hébergé sur une matrice à base de papier plutôt qu'à l'intérieur d'une cellule vivante. Duyen et ses collègues ont développé un in vitro système de transcription/traduction pour la détection d'antibiotiques qui inhibent la synthèse des protéines. Alors que le dispositif fonctionnait le plus efficacement à 37 °C (incubation de 2 h), la détection à une sensibilité comparable pouvait être obtenue de manière cohérente à des températures aussi basses que 15 °C en faisant varier le temps d'incubation. Avec une amélioration de la sensibilité actuellement de l'ordre de 500 à 6 100 ng/mL, ce système sur papier présente un potentiel d'utilisation sur le terrain (Duyen et al. 2017).


Affiliations

Département de biochimie et de biologie moléculaire, Institut de recherche sur la nutrition et la santé d'Al-Quds, Faculté de médecine, Université d'Al-Quds, Abu Deis, Cisjordanie, Palestine

Société de santé publique d'Al-Qods, Jérusalem, Palestine

Kifaya Azmi, Walaa Qrei et Ziad Abdeen

Faculté de médecine, Institut de recherche sur la nutrition et la santé d'Al-Quds, Université d'Al-Quds, Abu-Deis, P.O. Box 20760, Cisjordanie, Palestine

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Contributions

KA a été impliqué dans tous les aspects de la conception de la recherche, de la mise en œuvre, de la collecte d'échantillons et de la rédaction du manuscrit. WQ a participé à l'analyse de l'échantillon. ZA a contribué à la révision du manuscrit et au soutien global de cette étude. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

Auteur correspondant


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